生物分子組裝成凝聚體是細(xì)胞內(nèi)空間組織和細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的一個(gè)基本過程。繪制和描述生物分子的相行為對理解凝聚體的組裝機(jī)制和開發(fā)針對生物分子凝聚體系統(tǒng)治療策略至關(guān)重要。描述相分離系統(tǒng)的一個(gè)核心概念是相圖。相圖通常是通過對參數(shù)空間不同部分進(jìn)行大量單獨(dú)測量來建立。但是即使在微孔板格式下進(jìn)行，過程也是緩慢，低通量的，需要大量的樣品消耗。

近日，來自英國劍橋大學(xué)的Tuomas P. J. Knowles教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了組合式液滴微流控平臺的生物分子凝聚體相圖相關(guān)研究。研究成果以“Biomolecular condensate phase diagrams with a combinatorial microdroplet platform”為題于2022年12月21日發(fā)表在《Nat. Commun.》上。

本文提出了一個(gè)組合式液滴微流控平臺，稱為PhaseScan，用于快速和高分辨率獲取多維生物分子相圖。利用該平臺對各種條件下系統(tǒng)的相行為進(jìn)行分析，并證明PhaseScan可以定量分析小分子物質(zhì)對生物分子相變的影響。
  圖1 相位掃描工作流程

微液滴生成和成像的工作流程：作為一個(gè)模型系統(tǒng)，研究人員利用EGFP標(biāo)記的G156E突變體-肉瘤融合蛋白，即肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）病理蛋白，可用于相分離研究。通過蛋白質(zhì)EGFP標(biāo)簽觀察冷凝物的存在與否，將液滴分為相分離或相均勻。通常情況下，算法的假陽性和假陰性分類誤差總和<4%。凝聚體隨時(shí)間的推移而合并，與光漂白（FRAP）實(shí)驗(yàn)后的片外熒光恢復(fù)證實(shí)了PhaseScan實(shí)驗(yàn)中形成的凝聚體液體性質(zhì)。通過將確定濃度和相分離存在或不存在以每一液滴為基礎(chǔ)的散點(diǎn)圖結(jié)合，產(chǎn)生一個(gè)相圖。作為EGFP-FUSG156E和PEG濃度的函數(shù)，相邊界的位置和相分離的概率通過支持向量機(jī)（SVM）算法對相分離或同質(zhì)液滴的散點(diǎn)圖群體訓(xùn)練確定。相分離系統(tǒng)表現(xiàn)為動態(tài)變化，凝結(jié)液滴在成核后由于生長、凝聚和奧斯特瓦爾德成熟而不斷演變。同時(shí)研究液滴大小影響相界位置的可能性發(fā)現(xiàn)，液滴體積有調(diào)節(jié)成核驅(qū)動的凝結(jié)物生長動態(tài)傾向，PhaseScan實(shí)驗(yàn)報(bào)告的是相界的平衡位置，對液滴體積不敏感。
  圖2 PhaseScan在不同冷凝水系統(tǒng)中的應(yīng)用

驗(yàn)證完P(guān)haseScan系統(tǒng)操作后，研究人員圖利用平臺研究不同相分離系統(tǒng)，并測試該方法對同型和異型凝集物系統(tǒng)的通用性。由于核酸共存是相分離核糖核蛋白顆粒的一個(gè)決定性特征，首先制作EGFP標(biāo)記的FUSG156E在有polyU RNA情況下的凝集相圖，F(xiàn)USG156E相對于RNA低比例下沒有檢測到相分離，在較高FUSG156E濃度下發(fā)生相分離。研究表明凝結(jié)物的形成和蛋白質(zhì)-RNA共存是通過電荷中和發(fā)生，因此凝結(jié)是在RNA與蛋白質(zhì)離散比率下發(fā)生的。

為證明PhaseScan系統(tǒng)對其他相分離蛋白的適用性，對EGFP標(biāo)記的G3BP1的擁擠驅(qū)動相分離進(jìn)行表征，結(jié)果顯示G3BP1的相分離在高濃度PEG分子擁擠劑中出現(xiàn)，在更高蛋白濃度下得到加強(qiáng)。接著研究人員探測了人類冠狀病毒SARS-CoV-2（SARS-CoV-2 N）核衣殼蛋白的相分離，結(jié)果顯示：相分離以RNA依賴方式進(jìn)行，SARS-CoV-2 N相分離可以由RNA存在驅(qū)動，過量核酸濃度會導(dǎo)致冷凝液的溶解。總之，以上實(shí)驗(yàn)證明PhaseScan方法適用于廣泛冷凝液系統(tǒng)。該檢測方法可用于表征全長蛋白質(zhì)同型和異型相分離，包括觀察蛋白質(zhì)-RNA共沉淀物中的再入相分離行為。
  圖3 利用PhaseScan探測小分子調(diào)節(jié)劑對相分離的影響

接著研究小分子對相分離的影響。由于冷凝物形成過程與多種疾病有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病和癌癥。本研究關(guān)鍵在于提供高分辨率相圖，以準(zhǔn)確量化小分子調(diào)節(jié)劑對相分離平衡影響。使用小分bis-ANS對FUSG156E相分離調(diào)節(jié)，該化合物是各種相分離蛋白有效調(diào)節(jié)劑。在雙ANS的存在下，相界的位置明顯向低蛋白和低PEG濃度移動。總之，PhaseScan方法對小分子添加后蛋白質(zhì)LLPS行為的變化提供高分辨率評估。許多候選分子的影響是微小的，從一個(gè)候選小組中識別潛在物質(zhì)命中率需要高檢測分辨率。PhaseScan以最小樣品消耗實(shí)現(xiàn)高檢測分辨率，為高內(nèi)容庫的篩選提供有效方式。
  圖4 使用PhaseScan平臺生成多維相圖

環(huán)境因素可以觸發(fā)或調(diào)節(jié)生物分子相分離。但對環(huán)境影響的研究通常局限于二維化學(xué)空間分析，PhaseScan平臺能夠自動和高通量地生成大量溶液條件，對FUSG156E進(jìn)行一個(gè)三維（3D）參數(shù)空間PhaseScan實(shí)驗(yàn)。在高蛋白和PEG濃度下，相分離更有利。同時(shí)在較高濃度1,6-HD下，相分離會減少，因?yàn)?,6-HD會通過爭奪主要驅(qū)動蛋白質(zhì)LLPS的疏水相互作用來破壞蛋白質(zhì)凝聚物。作為蛋白濃度的函數(shù)，分子擁擠和1,6-HD對相分離的拮抗作用可以同時(shí)觀察。PhaseScan平臺在一次實(shí)驗(yàn)中評估相分離多種調(diào)節(jié)劑的能力，提供一種方便、高分辨率的手段，可用最小的樣品消耗來研究相分離機(jī)理變化。

總之，本文進(jìn)行了組合式液滴微流控平臺的生物分子凝聚體相圖相關(guān)研究。生物分子凝聚已經(jīng)改變了我們對細(xì)胞生物學(xué)的理解。PhaseScan平臺通過應(yīng)用微流控技術(shù)，為快速、高分辨率獲得LLPS相圖提供了基礎(chǔ)。PhaseScan方法適用于廣泛相分離系統(tǒng)，包括共存肽、人類蛋白和病毒蛋白，提供了一個(gè)有價(jià)值的工具，能夠快速、高分辨率分析相分離過程。PhaseScan還能提供高分辨率的相圖，以準(zhǔn)確量化小分子調(diào)節(jié)劑對相分離平衡的影響。同時(shí)PhaseScan還允許在一次實(shí)驗(yàn)中探索更高維化學(xué)空間。本平臺在篩選候選小分子方面可以實(shí)現(xiàn)多種藥物-蛋白質(zhì)組合的快速篩選。未來實(shí)驗(yàn)可以通過將高頻液滴生成與快速顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)更好的檢測產(chǎn)量，為高分辨率和高通量探索蛋白質(zhì)和核酸在各種條件下的相位變化開辟了一條道路。

文章來源：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-35265-7