代謝組學文獻分享，文章標題：Anthocyanin improves kidney function in diabetic kidney disease by regulating amino acid metabolism
發表期刊：Journal of Translational Medicine
影響因子：8.44
作者單位：中山大學附屬醫院
百趣提供服務：Label free定量蛋白質組學、非靶向代謝組學

代謝組學文獻分享-研究背景
目前超過40%的糖尿病(Diabetes mellitus, DM)患者中會存在糖尿病腎病(Diabetic kidney disease, DKD)，DKD是慢性腎臟疾病最重要的病因之一。花青素(Antho-Cyanins, ANT)是存在于各種食物中的多酚類化合物，在改善高血糖和胰島素敏感性方面發揮著重要作用。然而，目前ANT在DKD中的作用還知之甚少。本研究對DKD小鼠的腎臟和血清樣本進行了Label free定量蛋白質組學和非靶向代謝組學（百趣生物提供）的綜合分析，旨在評估ANT(cyanidin-3-O-glucoside [C3G])對DKD患者腎功能的影響，以及ANT的抗DKD作用是否與代謝途徑有關。

代謝組學文獻分享-技術路線

2.ANT對db/db小鼠蛋白表達譜的影響
基于Label free定量蛋白質組學的方法，作者對CT組（6只小鼠），DKD組（6只小鼠）和ANT組（5只小鼠）的腎臟組織和血清樣本分別進行了檢測。

在組織樣本中，一共鑒定出6355個蛋白質。代謝組學文獻分享，其中，DKDvsCT組和ANTvsDKD組分別鑒定出712和3642個差異表達蛋白(Differentially expressed proteins, DEPs)。為了確定ANT在腎臟中調控的靶蛋白，作者首先對CT、DKD和ANT組進行了STEM趨勢分析，并在樣例1、5、6、9、10和14中鑒定出了趨勢蛋白。ANT組中186個腎趨勢蛋白在DKDvsCT組和ANTvsDKD組中顯著差異表達，而ANT治療后可被抵消。在這些蛋白中，Mbl2(Mannose-binding protein C)、Cst3(cystatin C)和Vav1(Proto-oncogene vav)表達水平的升高可能會增加糖尿病腎病的風險。通過Metascape網站分析，ANT組腎臟趨勢蛋白主要富集在代謝途徑中，包括羧酸、α-氨基酸、含堿基小分子、甘氨酸、天門冬氨酸家族氨基酸、細胞修飾氨基酸和β-丙氨酸代謝（見圖2）。
 

圖2. ANT對小鼠腎臟蛋白表達譜的影響

在血清樣本中，一共檢測到1673種蛋白質，其中在DKDvsCT組和ANTvsDKD組分別鑒定出260和594個DEPs。作者觀察到ANT組中36個血清趨勢蛋白在DKDvsCT組和ANTvsDKD組之間有顯著差異表達，但在ANT治療后可以被抵消。代謝組學文獻分享，在這些蛋白中，Plvap(Plasmalemma vesicle-associated protein)、Itgb2(Integrin beta-2)和Rbp4(Retinol-binding protein 4)可能與糖尿病腎小球病變的嚴重程度增加有關。通過Metascape網站分析，ANT血清趨勢蛋白在補體和凝血級聯、血漿脂蛋白顆粒組織、細胞外基質組織、細胞-底物粘附調節、白細胞遷移調節和造血等方面均顯著富集（見圖3）。
 

 

圖3. ANT對小鼠血清蛋白表達譜的影響通過DKD組和CT組的比較，發現血清和腎臟樣本中共同檢測到31個DEPs，包括已知的糖尿病相關蛋白，如Serpina3k、Lpl、C1qb、Lgals3、Ctsd、Pdgfra、Apoc3、Apoc1、Lifr和Igfbp2，而在ANT組和DKD組血清和腎臟樣本中均檢測到178個DEPs。三組血清和腎臟中同時檢測到5個相同的DEPs(Capg、Pxdn、Mup20、Myh1和C8g)。相關性分析顯示，CT組、DKD組和ANT組中循環和腎組織蛋白之間無顯著相關性，提示ANT對腎蛋白和循環蛋白的治療作用是相互獨立的。

3.Db/db小鼠腎臟和血清代謝組學特征研究
作者比較了CT組和DKD組的腎臟和血清代謝組學。在腎臟和血清中，OPLS-DA模型顯示CT組和DKD組的代謝物分布有顯著差異。最終在CT組、DKD組腎臟和血清中分別鑒定出了228和171個DEMs。KEGG通路富集分析發現腎臟和血清中的DEMs分別有34條和23條通路顯著富集，主要涉及5類代謝異常，包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂類代謝、輔助因子和維生素代謝、核苷酸代謝。進一步，對兩組之間的通路活性進行了GSVA分析。

結果發現，在腎臟中，花生四烯酸代謝被列為表達升高最明顯的途徑，而脂肪酸生物合成活性下降。代謝組學文獻分享，此外，許多氨基酸代謝通路活性表達顯著降低，包括組氨酸代謝、賴氨酸降解、精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝和酪氨酸代謝。輔助因子和維生素代謝途徑表達也顯著降低，包括煙酸鹽和煙酰胺代謝、維生素B6代謝、泛酸鹽和輔酶a生物合成。碳水化合物代謝途徑，包括肌醇磷酸鹽和β-丙氨酸代謝表達顯著降低。血清中賴氨酸降解途徑表達升高，DKD組腎臟和血清中其他氨基酸代謝途徑活性下降。強調了DKD發病機制中不同生物實體中代謝物的不同改變（見圖4）。
 

圖4. DKD患者腎臟和血清的代謝特征

4.ANT對db/db小鼠代謝表達譜的影響
作者在ANTvsDKD組腎臟和血清中最終分別鑒定出311個和282個DEMs。為了確定腎臟和血清中ANT調控的靶向代謝物，本研究對CT、DKD和ANT組代謝物進行了STEM分析，并將樣例1、5、6、9、10和14中的代謝物確定為趨勢代謝物。進一步分別對腎臟和血清中的46和47趨勢代謝物進行層次聚類分析。分別對腎臟中DKDvsCT、ANTvsDKD組以及趨勢代謝物中的228、311和46個DEMs進行了分類，觀察到“有機酸及其衍生物”類豐富，“苯”類稀少。代謝組學文獻分享，此外，分別對血清中171、282和47個DEMs進行了分類。發現在趨勢代謝物中，“有機雜環化合物”類豐富，“核苷類、核苷酸類及類似物”和“苯”類很少。
 

圖5. ANT對小鼠腎臟和血清中代謝產物表達譜的影響
 

進一步對肝臟中的46種趨勢代謝物進行了GSVA分析，發現DKDvsCT組和ANTvsDKD組中，牛磺酸和次牛磺酸代謝途徑均有顯著改變，該通路在DKDvsCT組間表達下調，在ANTvsDKD間表達上調。此外，對血清中47種趨勢代謝物進行了GSVA分析。DKDvsCT組和ANTvsDKD組中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺生物合成途徑顯著改變。兩種通路在DKDvsCT之間表達上調，在ANT組和DKD組之間表達下調。代謝組學文獻分享，此外，DKDvsCT組和ANTvsDKD組中色氨酸和酪氨酸代謝途徑也顯著改變。兩種通路在DKDvsCT之間下調，在ANTvsDKD組之間上調。作者觀察到ANT處理后色氨酸代謝途徑中，血清中l-色氨酸和L-kynurenine下調，5-甲氧基吲哚乙酸和吲哚-3-乙醛上調。在酪氨酸代謝方面，ANT處理后馬來酸和富馬酸下調，吲哚5,6-醌上調（見圖6）。
 

圖6. 腎臟和血清中ANT趨勢代謝產物KEGG通路及被ANT改變的代謝通路的GSVA分析

代謝組學文獻分享-結論
綜上所述，該研究揭示了ANT在DKD中的多重改善作用，包括抑制空腹血糖、改善腎功能和腎臟組織病理學改變。通過采用Label free非標記定量蛋白質組學和非靶向代謝組學分析，探討了ANT減輕DKD腎臟損害的潛在機制。蛋白質組學和代謝組學分析表明，ANT有效地改變了db/db小鼠腎臟和血清的蛋白質組和代謝表型。檢測到了先前研究中報道的許多DKD相關血清和腎臟蛋白，驗證了本次的方法，同時觀察到ANT腎臟趨勢蛋白和代謝產物在氨基酸代謝中富集，主要在牛磺酸和低牛磺酸代謝中；ANT血清趨勢蛋白在補體和凝血級聯中富集，ANT血清的趨勢代謝產物在色氨酸和酪氨酸代謝中富集。通過本文的研究表明食物中的ANT可能是一種潛在的氨基酸代謝調節劑，可以改善腎功能和腎臟形態。揭示了飲食中使用ANT預防和治療DKD的潛在臨床效果。