SpectraMax Paradigm高通量藥物篩選平臺的應用
頂刊藥篩的選擇？發Cell和新冠藥篩都需要用到它
藥物篩選無論在醫學研究領域或是藥物開發領域都是十分重要的環節，在這個過程中篩選得到靶向特定靶點的高生理活性的化合物無疑是至關重要的。
現如今繁多的化合物種類和日漸增加的新靶點，都指向了高通量藥物篩選的必要性，而無論是使用較為傳統的ELISA，還是通過FRET、HTRF等方法，都可以通過高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm進行檢測，一次性完成6、24、96、384乃至1536/3456孔板的檢測，極大地提高了實驗效率和準確性，能夠更好地滿足實際實驗中藥物篩選需要。無論是發表在Cell上，篩選靶向TLS抗腫瘤藥物的研究，還是在新冠大流行背景下，對靶向新型冠狀病毒主蛋白酶的抗病毒藥物的篩選，或者是在常規實驗中檢測細胞內H2O2水平的需求，都可以通過SpectraMax Paradigm這一臺儀器完成，下文將具體就相關實驗的設計、結果與具體實驗流程展開介紹。
1. A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy Cell 66.850
在腫瘤治療領域當中，傳統的通過損傷DNA的方式殺傷腫瘤細胞的化學療法一直具有無法取代的地位。而在這種治療之下，細胞可以通過跨損傷合成（TLS）這個過程利用專門化的DNA聚合酶從而繞開DNA損傷的區域，以犧牲DNA保真度為代價促進細胞存活。而此篇文章的重大意義在于通過篩選找到了這樣一種可以靶向TLS過程的小分子抑制劑JH-RE-06，可以阻止誘變POLζ的募集來破壞誘變TLS，并且通過后續實驗驗證得到順鉑、JH-RE-06可雙藥聯合相較于順鉑的單藥化療來說對小鼠的耐藥腫瘤模型上顯示出更顯著的腫瘤抑制作用，并且可以降低由于化療所引起的繼發性腫瘤的可能性，從而降低傳統化學治療的副作用。
Figure 1 阻斷 REV1 CTD-REV7相互作用的小分子抑制劑JH-RE-06的發現與其特征
在化合物的篩選步驟中應用到了ELISA實驗。在 ELISA 實驗(Figure 1A)中，將純化后共表達REV3肽鏈的 His8-REV7固定在 Ni2+-NTA 包被的孔中，并通過辣根過氧化物酶(HRP)耦聯的抗FLAG抗體檢測其在小分子抑制劑存在情況下結合FLAG標記的cREV1 CTD的能力。作者選擇TMB作為底物，反應結束后通過使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm檢測450nm處的吸光度來尋找可以和REV1 CTD-REV7相互作用的小分子。在這個過程中，作者從LOPAC 文庫和PRESTWICK 文庫中篩選了1萬個結構不同的化合物，也在KCB（Korea Chemical Bank）化合物庫中篩選了具有代表性的化合物。最終鑒定得到JH-RE-06，可以10mM濃度下有效地抑制REV1-REV7相互作用，作為后續的研究對象[1]。
FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉移） 基于非輻射的能量躍遷。將一個蛋白上耦聯供體（donor），另一個蛋白上耦聯受體（acceptor），以下圖為例即供體為CFP，受體為YFP。當兩個蛋白間距離較遠時，CFP可以在433nm波長的熒光激發下發射475nm波長的熒光，而YFP不被激發；只有當供體和受體靠近時，即兩個蛋白之間存在相互作用時，可以發生FRET，使得YFP被激發，產生波長為530nm的熒光。可以應用于細胞內分子間相互作用、細胞膜受體蛋白之間相互作用等研究。而使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm的FI卡盒（Fluorescence Intensity）可以同時完成對雙熒光信號的檢測，檢測速度更快且結果更準確，不受光源強度、電壓等變化的影響。
FRET原理（Yamao, Masataka et al. PloS one. 25 Oct. 2016）
2. Both Boceprevir and GC376 efficaciously inhibit SARS-CoV-2 by targeting its main protease Nature communications 17.694
中國科學院微生物研究所齊建勛課題組在Nature Communications上發表的研究證實丙肝藥物博賽潑維（Boceprevir）和GC376（臨床前期藥物，針對貓傳染性腹膜炎病毒的抑制劑）可以通過靶向新型冠狀病毒的主蛋白酶（main protease，Mpro）起到病毒抑制作用。
Table 1. 18種待篩抗蛋白酶化合物
新冠病毒的主蛋白酶在病毒多聚蛋白的加工和成熟過程中起到重要作用，也因此是研發治療新冠病毒藥物的重要靶點。首先，作者發現了新冠病毒Mpro與其他冠狀病毒Mpro之間的同源性，因此選擇了靶向不同病毒蛋白酶和蛋白酶體的18種化合物進行進一步篩選（Table 1）。
Figure 1. 高通量藥物篩選
進一步作者通過在單一濃度下，在體外進行FRET實驗對這些化合物進行篩選（Figure 1 a, b）。最終發現有兩種抑制劑，即Boceprevir 和GC376，可以很好地抑制酶活性。RFU值（relative fluorescence units）是在37度的條件下，激發波長為360nm，發射波長為490nm，使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm檢測1小時得到[2]。
3. Involvement of NADPH oxidase 1 in UVB-induced cell signaling and cytotoxicity in human keratinocytes Biochem Biophys Rep. 3.322
Glady, Azela等人在這篇文章中試圖探究UVB-誘導的活性氧的來源和作用，最終得出結論：Nox-1介導的ROS的產生，是UBV通過p38激活和炎性細胞因子生成所導致的細胞毒性和炎癥所必須的，所以，作者認為Nox-1可以作為UVB接觸后所產生的細胞毒性和炎癥的一個可能的治療靶點。
在實驗的過程中作者需要對細胞內的H2O2水平進行檢測，主要通過向細胞內轉染H2O2敏感性探針pHyPer cDNA質粒，在完成穩轉株的構建后通過使用高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm對細胞熒光進行檢測，YFP與CFP激發波長的比值用來衡量細胞內H2O2的水平[3]。
Figure 1G
作者通過對Nox1的敲除發現可以抑制UVB誘導的即時或遲發的細胞內H2O2水平的升高，可以看出Nox1-siRNA組在UVB處理0.5h、3h和10h時，YFPex/CFPex的比值顯著低于對照組（Figure 1G）。高通量藥物篩選平臺SpectraMax Paradigm
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