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DNA甲基化的檢測方法詳細解讀

瀏覽次數:2949 發布日期:2023-3-22  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
一、DNA甲基化概述

表觀遺傳學是研究DNA序列不發生改變的前提下,基因的表達發生可遺傳變化的一門學科。表觀遺傳修飾的研究內容包含DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化、ADP-核糖基化等。DNA甲基化是人類最早發現的表觀遺傳修飾之一,屬于非組蛋白表觀遺傳現象。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶(DNA Methyltransferase, DNMTs)的催化下,將一個甲基(CH3)基團共價連接到胞嘧啶的5號碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶(5mC)的過程。哺乳動物體細胞的DNA甲基化主要發生在CpG島(CpG islands,C指胞嘧啶,G指鳥嘌呤,p指連接CG堿基的磷酸)。研究結果表明,基因調控元件(如啟動子)的CpG島發生5mC修飾會在空間上阻礙轉錄因子復合物與DNA的結合。因而DNA甲基化一般與基因沉默相關,非甲基化一般與基因的活化相關,而去甲基化一般與沉默基因的重新激活相關。

細胞的表觀遺傳修飾與細胞代謝、癌癥、衰老、心血管疾病及神經退行性疾病等多種疾病相關。受環境,疾病,性別和年齡等因素影響,DNA甲基化水平處于動態的變化過程。不同個體、組織與細胞之間,甚至是同一個體或細胞的不同發育時期,DNA甲基化的程度和狀態都可能存在差異。研究表明,DNA甲基化在基因調控、蛋白質表達、胚胎發育、細胞分化、X染色體失活以及疾病和腫瘤的發生、發展等過程中起重要的調節作用。

 

 
二、DNA甲基化的常見檢測方法

DNA甲基化具有重要的生物學功能,科學家們開發了大量的方法檢測DNA甲基化水平。

目前常見的DNA甲基化測定方法包括以下幾類:
1. 基因組甲基化水平的分析方法:包括高效液相色譜(HPLC)和高效毛細管電泳法(HPCE)。
2. 候選基因甲基化分析方法:包括甲基化敏感性限制性內切酶-PCR/Southern法(MSRE-PCR/Southern)、重亞硫酸鹽測序法(Bisulphite Sequencing)、甲基化特異性的PCR(MS-PCR)、甲基化熒光法、焦磷酸測序(Pyrosequencing)、以及結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法(COBRA)等。
3. 基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜方法:包括限制性標記基因組掃描(RLGS)、甲基化間區位點擴增(AIMS)、甲基化CpG 島擴增(MCA)、差異甲基化雜交(DMH)、由連接子介導PCR出的HpaII小片段富集分析、以及甲基化DNA免疫沉淀法等。

三、使用微孔板讀板機測定DNA甲基化

1. DNA甲基化檢測

DNA甲基轉移酶催化甲基基團共價連接到胞嘧啶的5號碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶(5mC),5mC是最早被發現,也是研究最多的修飾堿基,在基因表達調控、生物生長發育和疾病發生等過程中發揮重要作用。5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)是在哺乳動物胚胎干細胞和人、小鼠腦細胞中表達的一種修飾,它可以把胞嘧啶羥甲基化。DNA 甲基化水平是一個DNA 甲基化和DNA 去甲基化的動態調控的過程。研究結果表明,5mC可以導致基因沉默或基因表達水平降低,而5hmC作為去甲基化過程的第一步,會導致基因激活或基因表達水平升高。分析5mC和5hmC在不同細胞和基因組不同區域的含量和比例,對于確認健康和疾病的細胞/組織中的甲基化修飾變化具有重要意義。高效液相色譜法(HPLC), 薄層色譜法(TLC)和質譜等基于層析的技術都可以被用來檢測5mC和5hmC,但是它們步驟復雜,耗時,且成本較高。

利用微孔板讀板機(酶標儀)進行DNA甲基化相關實驗測定靈敏度高,特異性好,并且整個操作步驟簡易,快速。可以利用Molecular Devices酶標儀,結合DNA甲基化檢測分析試劑盒,通過光吸收法或熒光法定量檢測不同樣本的甲基化DNA(5mC)和羥甲基化DNA(5hmC)。

 

2. DNA甲基轉移酶檢測

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要部分,DNA甲基化模式的改變會導致腫瘤及多種疾病的發生,例如在很多腫瘤中都發現DNA甲基轉移酶(DNMTs)的表達異常。對DNA甲基轉移酶的研究不僅可以揭示DNA甲基化對基因表達調控的機制,對腫瘤等疾病的治療也具有潛在意義。

 

作為甲硫氨酸的活性形式,s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl-methionine,SAM)在生物體內的各種代謝過程中起重要作用,參與催化人體內多種不同甲基轉移酶,并且與多種甲基轉移酶的活性密切相關。SAM作為甲基供體,在甲基轉移酶的催化作用下,可以將甲基基團轉移到相應底物上,隨后生成s-腺苷高半胱氨酸(s-adenosyl-l-homocysteine,SAH)。甲基轉移酶通用酶活評價分析方法就是利用這一特性,通過檢測SAH的含量變化,從而評估催發反應中甲基轉移酶的活力和反應效率等。

Elisa作為傳統的方法,存在實驗步驟多,需要經過多次洗板、加樣、顯色等操作步驟,耗時長,結果不穩定等不足。可以利用Molecular Devices酶標儀,結合均相時間分辨熒光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF)的方法檢測甲基轉移酶,這種檢測方法適合幾乎所有甲基轉移酶和底物的檢測,操作步驟簡單、靈敏度高且無放射性污染。


優勢:
• 擁有 HTRF 兼容性認證,確保儀器性能
• 高度穩定、均質的高通量檢測
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發布者:美谷分子儀器(上海)有限公司
聯系電話:4008203586
E-mail:info.china@moldev.com

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