嵌合抗原受體（CAR）是經過工程改造的合成受體，能重定向淋巴細胞（最常見的是T細胞），以識別和消除表達特定靶抗原的細胞。CAR與細胞表面表達的靶抗原的結合獨立于MHC受體，會導致劇烈的T細胞活化和強大的抗腫瘤反應。現如今，CAR-T細胞在治療B細胞白血病或淋巴瘤的某些亞群以及多發性骨髓瘤中產生了顯著的臨床反應，但同時存在多方面的局限性使其難以進一步發揮療效，如嚴重的毒副作用、抗原逃逸、有限的腫瘤浸潤、腫瘤微環境的抑制等。

為了更好地梳理CAR-T細胞治療的研究現狀，我們將從3個方面展開論述：
1. 介紹CAR結構及其設計原則
2. 盤點CAR-T細胞治療的局限性及潛在風險
3. 如何打破困局、提升治療效果的創新策略

今天就先來講講「CAR結構及其設計原則」的相關內容。CAR是模塊化合成受體，由4個主要部分組成：細胞外靶抗原結合結構域、鉸鏈區域、跨膜結構域、一個或多個細胞內信號結構域。

01.抗原結合域
抗原結合結構域是CAR中賦予靶抗原特異性的部分，通常來源于抗體的重鏈可變區（Viarable Heavy chain, VH）和輕鏈可變區（Viarablelight chain, VL），通過柔性接頭連接形成單鏈可變片段（Singlechain fragment variable, scFv）。該部分可以直接識別腫瘤細胞表面抗原，進而導致MHC非依賴性T細胞活化。

scFv不僅是識別和結合目標表位，還有幾個重要特征會影響CAR的功能。例如，VH鏈和VL鏈之間的交互模式以及互補決定區域的相對位置均會影響CAR對其靶表位的親和力和特異性。為了識別腫瘤細胞上的抗原，誘導CAR信號傳導并激活T細胞，CARs抗原結合親和力必須足夠高，但不能高到導致表達CAR的細胞的活化誘導死亡并觸發毒性。為了優化CAR與其靶抗原的結合，必須考慮其他因素，如表位位置、靶抗原密度，且避免與配體非依賴性強直信號傳導等。

02.鉸鏈區域
鉸鏈或間隔區被定義為從跨膜結構域延伸到結合單元（scFv）的細胞外結構區。鉸鏈能提供克服空間位阻的靈活性，以允許抗原結合結構域進入靶向表位。其長度和組成差異會由多方面影響CAR-T細胞的功能，包括：結合的靈活性、CAR分子表達、信號傳導、表位識別、激活輸出強度和表位識別等。除此之外，有研究指出間隔長度對于提供足夠的細胞間距離以允許免疫突觸形成也至關重要。

最常用的鉸鏈區域通常來源于CD8、CD28、IgG1或IgG4的氨基酸序列。其中，IgG衍生的間隔物可導致CAR-T細胞耗竭，從而降低體內持久性，因為它們可以與Fcγ受體相互作用。目前一些研究試圖通過對IgG Fc受體結合部位進行突變來克服其這一缺陷。

03.跨膜結構域
跨膜結構域的主要功能是將CAR錨定在T細胞膜上，但也有證據表明，它可能與CAR-T細胞功能相關。CAR跨膜結構域可以影響CAR表達水平、穩定性，在信號傳導或突觸形成中發揮作用，并與內源性信號分子二聚化相關。

大多數跨膜結構域來源于天然蛋白質，包括CD3ζ、CD4、CD8α或CD28等。由于CD3ζ跨膜結構域介導CAR二聚化并摻入內源性TCR，CD3ζ跨膜區可能促使了T細胞活化，但同時也降低了CAR穩定性。另外，因為跨膜結構域和鉸鏈區域會影響CAR-T細胞因子的產生和活化誘導的細胞死亡（activation induced cell death, AICD），相比于CD28，具有CD8α跨膜和鉸鏈結構域的CAR-T細胞釋放的TNF和IFN-γ量減少，其對AICD的敏感性降低。

總的來說，通過將近端細胞內結構域連接到相應的跨膜結構域，可以促進適當的CAR-T細胞信號傳導；通過使用CD8α或CD28跨膜結構域，可以增強CAR表達和穩定性。

04.胞內信號傳導結構域
在CAR分子結構中最受關注的原件應該是CAR共刺激結構域。

1990年代后期設計的第一代CAR包含CD3ζ或FcRγ信號結構域，但由于其體外耐用性和持久性并不理想，在臨床上也僅顯示有限療效或沒有療效。

基于共刺激結構域對持久治療具有重要作用的理解，產生了具有一個共刺激結構域的第二代CAR，其在結構上與CD3ζ細胞內信號結構域串聯。目前，FDA批準的CAR-T治療產品中兩個最常見的共刺激域CD28和4-1BB（CD137）都與高患者反應率有關。臨床上，第二代CAR-T細胞在慢性淋巴細胞白血病、B細胞急性淋巴細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤和多發性骨髓瘤等多種血液系統惡性腫瘤中產生了較強的治療反應；關于實體瘤主要應用于膠質母細胞瘤、晚期肉瘤、肝轉移瘤、卵巢癌等；此外還存在幾種替代的共刺激結構域。

據推測，僅通過一個結構域的共刺激會產生不完全激活。因此第三代CAR應運而生，其包含兩個與CD3ζ串聯的共刺激結構域，但其臨床前研究產生了不同甚至相互矛盾的結果，在應用轉化方面仍存在較多掣肘。
 

優化CAR設計乃至全流程研發

CAR分子是影響CAR-T細胞治療有效性的關鍵，因此，認識CAR分子的組成結構，并結合研究實際情況來選擇恰當的CAR設計，對臨床前研究有著重要作用。通過優化CAR親和力，或是選擇適當的共刺激結構區等方式，以使CAR-T細胞在體內持久存在，并維持其殺傷功能，能進一步確保該療法的有效性和安全性。

基于多年在腫瘤免疫領域的研究經驗，賽業生物可為CAR-T/其它細胞治療研究者提供專業的定制化的CAR分子設計服務。不僅如此，我們能給予你關于CAR-T/其他細胞治療研發的全方位支持，從抗體開發、CAR病毒制備、免疫細胞制備和表型檢測，到細胞模型與動物模型的構建、體外/體內藥效評價一應俱全。

參考文獻：
[1] Sterner RC, Sterner RM. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 2021 Apr 6;11(4):69. doi: 10.1038/s41408-021-00459-7. PMID: 33824268; PMCID: PMC8024391.