文章標題：Applying multi‐omics toward tumor microbiome research
發表期刊：iMeta

作者單位：俄亥俄州立大學醫學院放射腫瘤學系、俄亥俄州立大學詹姆斯綜合癌癥中心癌癥代謝中心、俄亥俄州立大學醫學院生物化學和藥理學系腫瘤微生物在腫瘤發生、發展、轉移和治療過程中起著重要作用，且極有可能成為腫瘤早期診斷和治療的標志物，但同時也存在一定的挑戰，如腫瘤內微生物含量低和不可培養，因此亟需新的高分辨率的技術來支持后續的研究。多組學技術（基因組學，轉錄組學，蛋白質組學和代謝組學）能從不同層次闡述腫瘤微生物，將對未來微生物與腫瘤微環境相互作用的研究產生巨大影響。本文系統總結了多組學技術的研究進展及其在腫瘤微生物組研究中的應用，為研究者提供了一個可供參考的組學工具箱。

1.引言
腫瘤微環境(Tumor Microenvironment, TME)中存在微生物并受其影響，目前地球上大約有1012種已知的微生物，只有11種被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer, IARC)確認為“腫瘤微生物”。研究人員發現微生物活體存在于多種腫瘤中（乳腺癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺癌、皮膚癌、腎細胞癌，胃癌、肺癌、前列腺癌和鼻咽癌等；圖1），而且不同類型腫瘤中的微生物有驚人的相似之處。腫瘤內微生物通過DNA損傷、致癌激活途徑、抗腫瘤藥物分解代謝和免疫系統調節等多種機制影響腫瘤的發展和治療（如：大腸桿菌釋放能夠誘導致癌DNA突變的基因毒素；幽門螺桿菌通過誘導炎癥和影響調節粘膜細胞生長和增殖的關鍵細胞內信號通路；用于治療胰腺導管腺癌的化療藥物吉西他濱被腫瘤內細菌代謝至失活狀態，從而導致耐藥性）。
 

圖1. 微生物的致癌作用以及多組學方法研究腫瘤微生物

2.用于腫瘤微生物組研究的基因組學和轉錄組學
基因組學和轉錄組學專注于研究參與基因表達調控的核酸（DNA和RNA）。目前，使用最廣泛的測序技術（圖2）包括三種二代測序系統（即Illumina、Ion Torrent、BGI）和兩種三代測序技術（即PacBio和納米孔）。這些測序方法（DNA測序，RNA測序，16S rRNA測序，表觀遺傳學測序（如ChIP-seq和DNA/RNA甲基化測序）和三維基因組技術）是發展各種基因組和轉錄組研究方法的基礎。此外，基因編輯工具的最新研究進展已經能夠在全基因組水平上進行多基因操作。
 

圖2. 用于腫瘤微環境研究的基因組和轉錄組研究技術

2.1 DNA測序
DNA-seq通常用于三種類型的基因組分析：全基因組測序(Whole Genome Sequencing, WGS)、全外顯子測序(whole exome sequencing, WES)和靶向測序。隨著DNA技術的快速發展，DNA-seq正成為研究不可培養微生物（包括人類微生物組中的微生物）的有力工具。基因組文庫的測序和異源表達極大地促進了我們對代謝途徑和腫瘤微生物生理的理解。

2.2 16S rRNA測序
16S rRNA測序是一種專門針對細菌和古細菌表達的30S核糖體亞單位16S的測序技術；該序列包含交替的高度保守和高變區；保守區可用于設計擴增靶向片段的通用引物，而高變區的分析可用于鑒定特定的細菌物種，盡管一些注釋可能低于物種水平。在腫瘤微生物組領域，16S rRNA測序主要用于研究群落中物種的組成、物種間的進化關系以及微生物群落多樣性。

2.3 RNA測序（RNA-seq）
RNA-seq是一種轉錄組測序方法，其中高通量測序方法用于研究復雜樣品中不同RNA的群體，包括信使RNA(messenger RNA, mRNA)、轉運RNA(trainsfer RNA, tRNA)、非編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA)和微小MicroRNA(micro RNA, miRNA)等。在過去幾十年里，RNA-seq技術已成為在轉錄組水平上分析基因表達不可或缺的工具。在RNA生物學領域，RNA-seq已廣泛應用于研究單細胞基因轉錄、蛋白質表達和RNA結構。RNA-seq技術的進步也進一步促進了空間轉錄組學的出現和發展；直接長閱讀或全長RNA-seq方法、以及不斷更新的數據分析方法，使研究人員能夠更好地了解RNA生物學（包括轉錄過程機制以及折疊和分子間相互作用對RNA功能的影響）。總的來說，RNA-seq是通過基因轉錄水平上的分析來研究癌細胞和腫瘤微生物組通路交互影響的強有力工具。

2.4 表觀遺傳學技術
表觀遺傳學研究不涉及DNA序列改變的表型變化。與遺傳調節不同，典型的表觀遺傳變化（包括DNA/RNA修飾和組蛋白翻譯后修飾）是可逆的，且不影響細胞基因組序列。在真核細胞中，核小體作為染色質組織的基本重復單位，主要由圍繞核心組蛋白八聚體纏繞1.5次的147個堿基對組成（如兩拷貝H2A、H2B、H3和H4）。DNA、RNA和組蛋白的共修飾是調控特定基因激活和抑制的關鍵機制。表觀遺傳調控在研究與人類疾病特別是癌癥密切相關的DNA復制、轉錄和損傷修復過程中起重要的調控作用。

DNA甲基化在不改變基因序列的情況下調控轉錄，而腫瘤抑制相關基因表達的關閉會導致腫瘤的發生。大量研究表明DNA異常甲基化與多種腫瘤的發生發展密切相關，因而DNA甲基化水平的改變常被檢測為腫瘤診斷的標志。目前，已經開發了多種DNA甲基化測序技術，如全基因組亞硫酸氫鹽測序(Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)，簡化的亞硫酸氫鹽測序(Reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)，氧化亞硫酸氫鹽測序(oxBS-seq)和無細胞甲基化DNA免疫沉淀和高通量測序(cfMeDIP-seq)。

組蛋白翻譯后修飾(Post-translational Modifications, PTMs)包括甲基化、磷酸化、乙酰化、巴豆酰化、泛素化、糖基化、糖化和ADP核糖基化，不同組蛋白PTMs被認為與癌癥的發生發展有關，如微生物的甲基乙二醛合酶(methylglyoxal synthases, MGSs)可以促進TME中甲基乙二醛的生成；組蛋白MGO(methylglyoxal)-糖基化被發現通過影響染色質的三維結構影響腫瘤的發展。

此外，染色質免疫沉淀測序(Chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)是基因轉錄水平組蛋白修飾的最常用方法之一，該技術起初主要用于研究蛋白和DNA的相互作用。ChIP技術主要用于研究胞內相互作用和對研究基因水平的表觀遺傳學改變；ChIP-seq結合了ChIP和二代DNA測序技術，可以有效地檢測特定組蛋白修飾和轉錄因子的DNA結合位點。ChIP-seq的原理為：DNA片段純化與目標蛋白質結合并通過ChIP純化富集和免疫共沉淀，然后純化并構建文庫，富集的DNA片段通過高通量技術進行測序；借助該技術，研究人員已經精確定位了基因組中與特定組蛋白相互作用的序列和轉錄因子。對于腫瘤微生物組研究而言，ChIP-seq技術適用于宿主和微生物細胞的基因組或表觀遺傳學研究。

2.5 三維基因組學
三維基因組學亦即空間基因組學，主要基于一維（1D）基因組序列的基本信息，研究基因組的三維結構和不同元件（包括轉錄因子和DNA/RNA結合蛋白）介導的轉錄調控機制。近年來，在該領域發展的技術主要包括高通量/高分辨率染色體構象捕獲(high‐throughput/resolution chromosome conformation capture, Hi-C)，基于微球菌核酸酶的染色體折疊分析(micrococcal nuclease‐based analysis of chromosome folding, Micro-C)，使用長x-接頭的基于微球菌核酸酶的染色體折疊分析(micrococcal nuclease‐based analysis of chromosome folding using long x‐linkers, Micro-C XL)，通過成對末端標簽測序的染色質相互作用分析(chromatin interaction analysis by paired‐end tag sequencing, ChIA-PET)和HiChIP(in situ Hi‐C followed by chromatin immunoprecipitation)。

與腫瘤微生物組相關的研究主要集中于宿主細胞的真核基因組，最近Hi-C技術開始用于細菌染色體的研究，為生物樣本DNA序列的物理鄰近性提供依據。

2.6 基因組編輯
基因編輯也稱為遺傳修飾或基因工程，主要用生物化學的方法改變基因組序列，主要通過在基因組中插入目標片段或刪除特定片段來實現。基因編輯歷史悠久，常見工具包括轉錄激活因子樣效應核酸酶(transcription activator‐like effector nucleases，TALENs)、成簇規律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和CRISPR‐associated protein 9(Cas9)等。目前，CRISPR-Cas9技術及其衍生的技術是基因組編輯的主流技術。

腫瘤微生物組研究領域，基因編輯技術已廣泛用于宿主和微生物，發現腸道微生物的基因組組成變化很大。單核苷酸多態性(SNPs)的系統發育分析顯示了全球宏基因組樣本中顯著的種內遺傳變異。因為我們可以看出CRISPR‐Cas9技術在菌群研究領域有較好的應用前景。

2.7 單細胞基因組學和轉錄組學
基因組和轉錄組學方法能提高覆蓋率同時降低假陽性，但組裝正確率取決于測序深度和群落復雜性，如宏基因組技術能研究復雜群體的細菌組成，但低豐度菌的序列可能被高豐度生物的序列掩蓋。此外，具有相似表型的細胞中的遺傳信息可能存在顯著差異，且低豐度信息可能會丟失。單細胞測序技術彌補這些局限性的同時，可以揭示單個細胞的基因結構和基因表達，同時能更好地反映細胞間的異質性。

目前單細胞基因組和轉錄組主要基于4種研究方法：瓊脂平板稀釋、基于精細毛細管移液分離和倒置顯微鏡的單細胞外顯子組測序、基于液滴的微流體技術和改進的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)法，而其中關鍵的一步是從組織或其他來源制備單細胞懸液。

2.7.1 瓊脂平板稀釋法
通過平板劃線獲得單一微生物的純培養物，然后反復稀釋微生物或不同細胞類型的混合物，從而將不同的群落分離成單細胞，這些單細胞將生長成同質菌落（圖3A）。微流控劃線平板(microfluidic streak plate, MSP)技術基于微流控的傳統平板劃線技術。MSP使用微流體得到微液滴，在培養皿上劃線培養單細胞。傳統瓊脂平板稀釋和MSP都可以整合到高通量篩選工作流程中。

2.7.2 基于倒置顯微鏡和口吸毛細管移液系統方法
組織樣本的細胞懸浮液在倒置顯微鏡下用口吸毛細管系統或其他單細胞移液系統進行處理得到單細胞。分離的單細胞經確認后隨機置于PCR管中，然后通過全基因組擴增(whole genome amplification, WGA)獲得基因組序列信息，同時可用于外顯子組測序（圖3A）。這種技術已被用于研究腎細胞癌和鄰近腎組織的研究，發現腫瘤的發生比以前認為的更復雜，并促進了更有效的細胞靶向治療的發展。由此我們也可以斷定，這種方法也可用于研究單個腫瘤細胞內的微生物的研究。

2.7.3 微滴微流體法
該方法主要用于基于兩種不相容的液體來制備液滴，液滴的產生主要基于微管結構和兩種液體之間的流速（圖3A），固定流速的泵驅動兩種液體進入不同的微通道，當它們相遇便產生微滴；這些液滴是理想的微反應室，可容納單個細胞。單個液滴可通過系統進行填充、操作、分離、組合、檢測和分類，從而得到數千個液滴。微滴微流體可以從大量細胞群中分離出單個細胞，通過一系列酶促步驟提取和分割基因組，遺傳物質被擴增和標記后進行單細胞測序。該技術結合了微流體技術、DNA條形碼和測序技術。

被包埋的微生物可以直接在液滴中培養，并在第一次擴增過程中生長上百個細胞，然后裂解純化，用細胞分選儀將含有單細胞擴增DNA的珠子分選到標準PCR板中，隨后再擴增到單細胞擴增基因組(single‐cell amplified genome, SAG)文庫中。基于SAG-gel平臺的典型單細胞測序方法（圖3A）的微流控液滴發生器已用于在瓊脂糖凝膠珠中培養小鼠腸道微生物。

包埋的單一微生物也可以直接裂解，然后進行DNA擴增或RNA逆轉錄和條形碼標記。對于單細胞基因組測序，細胞通常首先被擴增，然后進行標記；單細胞轉錄組測序，通常首先標記細胞RNA，然后逆轉錄，最后是互補DNA(cDNA)擴增（圖3A）。為了研究細胞內的核小體，核小體必須首先用條形碼標記，然后進行免疫沉淀(single-cell ChIP-seq)和DNA擴增（圖3A）。微滴微流體技術可以分析數百萬個獨立的反應，目前該技術也被用于單個DNA分子的深度測序，通過單細胞芯片測序和高通量分析對被標記的核小體進行分析。

微滴微流控單細胞測序無需單獨培養微生物即可對細胞進行測序。通過這種方法，可以得到宏基因組數據庫以研究腫瘤和其他區域（如腸道）中的微生物。這種方法的局限性在于，它從單拷貝基因組開始，但在酶和微流體處理過程中信息的損失不可避免，從而降低單個細胞信息的覆蓋率。

2.7.4 改進的熒光原位雜交法
熒光原位雜交(FISH)是研究培養微生物的重要工具，可用于鑒定單細胞，也可用于標記靶向RNA（圖3B）。RNA拷貝數可以反應在熒光水平上，因此該技術尤其適用于靶向rRNA的檢測。16S rRNA不同區域的保守度不一樣，可以根據菌類型設計特異性的引物。

為解決分辨率低的問題，研究者們又開發了一些其他的方法，如催化報告分子沉積-熒光原位雜交(catalyzed reporter deposition‐FISH, CARD-FISH)使用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的探針以指數倍數放大信號，以便對單細胞進行特異性的熒光標記；Highly phylogenetic resolution FISH(HiPR‐FISH)技術在已有的單細胞自動圖像分割的基礎上執行像素分類和圖像優化濾波。這些技術的發展對特定的微生物種群、含量低微生物和極低拷貝數RNA的可視化和分類及實現單細胞定量有重要作用。FISH可能會首先用于鑒別和定位腫瘤組織中的微生物。
 

圖3. 單細胞基因組和轉錄組方法

2.8 蛋白質組學
基因和轉錄的表達和調控水平可直接反應在成千上萬的蛋白質的表達、PTMs和蛋白-蛋白間的相互作用水平上。液相色譜-質譜聯用技術(Mass spectrometry coupled with liquid chromatography, LC-MS)是蛋白質研究中最常用的方法之一，且已成為腫瘤微生物組研究的有力工具。蛋白質組學研究有三種不同的策略：top‐down，middle‐down 和bottom‐up；其中top‐down（圖4A）直接用MS對目標蛋白質進行檢測，無需其他預處理；middle‐down首先將蛋白質酶解成大的肽段，然后用質譜進行檢測；bottom‐up也稱為鳥槍法，是使用最廣的一種方法，蛋白質酶解成含有6-20個氨基酸的肽段（圖4B）。

蛋白質組學的研究主要是篩選健康和疾病間的差異表達蛋白。目前基于質譜的蛋白質組學主要方法有數據依賴采集(data‐dependent acquisition，DDA)和數據非依賴性采集(data‐independent acquisition, DIA)（圖4B）2種。在串聯質譜（MS/MS）中，DDA只對部分母離子進行二級掃描；而DIA對所有母離子的MS2信息進行采集，因此DIA已成為臨床樣本（如腸道微生物樣本）機制和生物標志物篩選研究中最受歡迎的數據采集方式，且DDA主要用于靶標檢測。靶標蛋白質組學技術主要通過PRM(parallel reaction monitoring)或MRM(multiple reaction monitoring)方式對樣本中的目標蛋白進行檢測。蛋白定量包括相對定量和絕對定量，絕對定量首先通過標準曲線對樣本中的蛋白進行定量；相對定量無需標準曲線，通過相對含量確定蛋白在2樣本中差異倍數。

相對定量中，又有標記和非標記2種方法；非標記定量不需要同位素標記蛋白就可對不同生物樣本中的蛋白質進行相對定量；標記定量主要有iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)，TMT(tandem mass tag)和SILAC(stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture)，主要用同位素標簽標記或者替換相應氨基酸；TMT（圖4D）和iTRAQ主要用于體外標記，而SILAC用于體內標記（圖4C）。標記的方法可將不同來源的蛋白的含量通過一次實驗檢測出來，且對低豐度蛋白和PTMs含量的改變有較好的靈敏度。
 

圖4. 蛋白質組學的不同技術

2.9 代謝組學
代謝組學技術主要用于檢測生物體內代謝物。代謝組學在腫瘤微生物組研究中致力于識別腫瘤微生物的代謝差異及其與周圍環境的相互作用，能加深對腫瘤微生物影響腫瘤機制的理解。與微生物相關的代謝物主要包括短鏈脂肪酸(short‐chain fatty acids，SCFAs)、氨基酸類代謝物 、維生素、膽汁酸(bile acids, BAs)、乳酸、毒素和甲酸鹽等。許多研究表明，微生物相關的代謝物可以正向或負向調控免疫、炎癥、信號通路或改變腫瘤微生物（圖5A），從而顯著影響腫瘤的發生和發展。

SCFAs是腸道菌群的主要代謝物之一，可以對腸道功能和腸道代謝產生正向或負向的影響；另外已有研究發現補充某些產生SCFA的菌可以抑制腸道腫瘤的發展；此外，SCFAs也有望成為結直腸癌的診療靶點。異戊酸(Isovaleric acid, IVA)是一種與結直腸癌相關的腸道微生物相關的SCFA，可以促進蛋白質的表達進而導致下游5-羥色胺（5-HT）的增加；5-HT可直接作用于腫瘤干細胞，促進自我更新而增加腸道腫瘤發生。

微生物的其他代謝物也可以調節T細胞的代謝，如異石膽酸可以增強氧化磷酸化和線粒體ROS，促進調節性T細胞分化；一些回流BA可增加促進胃癌的發生的牛脫氧膽酸的產生。產毒素細菌艱難梭菌可激活腸上皮祖細胞中的信號通路，增加ROS產生和促進腫瘤的黏膜免疫反應；具核梭桿菌分泌的甲酸鹽可以激活增加結直腸癌細胞的侵襲力相關的信號通路；來自腸道菌群的氧化三甲胺(Trimethylamine oxide, TMAO)增強CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫；沒食子酸是腸道微生物的另一種代謝產物，也已被證明可以調節Treg細胞并增強癌癥免疫治療。腸道細菌及其代謝產物可通過誘導突變、增強腫瘤相關促炎反應、招募免疫抑制細胞等方式促瘤；腸道真菌還可以誘導促瘤炎癥微環境，并產生真菌毒素從而誘導突變，促進腫瘤。
 

圖5. 用于腫瘤微生物組研究的代謝方法

2.9.1 腫瘤微生物相關代謝物分析和樣本預處理方法
代謝組學主要有NMR(nuclear magnetic resonance)和MS(mass spectroscopy)兩個平臺；NMR非破壞性的且不依賴于分離技術、樣品制備相對較快、操作簡便、成本低；向樣品中加入已知濃度的內標化合物可以提高NMR的絕對定量；由于NMR靈敏度相對較低、微生物代謝物的復雜性以及代謝物濃度范圍跨度大，從而限制了該平臺在微生物代謝組學中的應用。

高分辨率MS成為代謝組學研究中的主流平臺。利用包括LC、氣相色譜(gas chromatography, GC)和毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)在內的分離技術克服了NMR平臺存在的問題并廣泛用于微生物代謝組學。GC-MS由于性能穩定且結果重現性好而廣泛用于代謝組學研究，但GC-MS主要用于揮發性和熱穩定性低分子量化合物的檢測，而大多數微生物代謝物（如磷酸化化合物）是非揮發性的和熱不穩定的代謝物，因此，對于微生物來源的代謝物需要經衍生化處理。

與GC-MS和LC-MS相比，CE-MS用于代謝組學研究有較好的分辨率、所需樣品量少且成本低，而CE和MS間的連接問題限制了其在代謝組學領域的應用。與其他技術平臺相比，LC-MS和LC-MS/MS可以不經衍生化處理檢測極性和高分子量物質，樣品制備方便；此外，LC-MS靈敏度高，所需樣品量少；此外，超高效液相色譜(ultrahigh performance liquid chromatography, UHPLC)的出現大大提高了LC-MS的色譜分辨率。

代謝組學主要分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學；非靶向代謝組學對樣本中的所有物質進行檢測，而靶向代謝組學是指基于SRM和標準曲線對目標代謝物進行相對或絕對定量，TQMS(triple quadrupole MS)和傳統的離子阱質譜(ion trap mass spectrometers, iTRAQ)是靶向代謝組學研究的主要技術平臺。四極桿飛行時間(quadrupole time of flight, Q-TOF)質譜儀、傅里葉變換離子回旋共振(Fourier‐transform ion cyclotron resonance, FT-ICR)質譜儀和基于離子阱質量分析器軌道阱的質譜儀(Orbitrap)等高分辨率質譜儀，因采集速度快而廣泛用于非靶向代謝組學研究。

鑒于胞內代謝隨時間和外部環境快速變化，因此，取樣和樣品制備的方法和條件（如時間和儲存條件等其他因素）對代謝檢測的重現性、精密度和準確度有較大的影響。樣品制備主要分為代謝淬滅和代謝物提取兩個過程，淬滅是在盡量不損傷細胞膜的情況下快速停止胞內代謝；快速收集好的組織或細胞樣品可快速置于液氮中淬滅，然后-80℃保存；此外，冷凍淬火和化學淬火或用酸或冷甲醇水溶液淬滅也是常用的淬滅方法。

樣本中代謝物的提取可以通過物理方法，手工研磨或使用組織勻漿器實現，其中基于甲醇、氯仿和乙腈等的有機溶劑萃取由于提取效率高而常用于代謝物的提取，此外有機溶劑提取法對LC-MS的離子抑制效應也更小；基于NMR的分析方法無需對樣本進行處理，樣品制備簡單。LC-MS和NMR在微生物相關代謝物檢測分析方面各有其自身的優缺點，研究人員可以根據感興趣化合物的特性和自身平臺的特點來選擇合適自己研究的方法。

2.10 單細胞蛋白質組學和代謝組學
單細胞測序主要用于細胞基因組、轉錄組和表觀基因組的研究；同樣，單細胞蛋白質組和單細胞代謝組在單細胞水平的基因組和轉錄組水平的研究中也有重要作用，但單細胞蛋白和代謝物的信號不能被放大；追蹤是代謝組和蛋白組學研究中最大的挑戰，因為這對于減少樣品處理過程中細胞內分析物的損失至關重要。

單細胞蛋白質組學研究之前由于缺少明確和普遍適用的方法而只處于起步階段；隨著MS靈敏度的提高和樣品制備方法的不斷改進，單細胞蛋白和復合蛋白的絕對定量取得很大的進展。

基于Orbitrap的高分辨質譜在離子傳輸效率、檢測靈敏度和分辨率等方面得到了極大的改善，尤其是最新一代的Orbitrap Eclipse MS上分析單個HeLa細胞研究發現，肽段和蛋白的覆蓋率分別增加了36%和20%；最新的質譜儀器，如傳統遷移譜(drift tube‐based ion mobility spectrometry, DT-IMS)，捕獲離子淌度質譜(trapped ion mobility spectrometry, TIMS)和高場非對稱波形離子遷移譜(high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, FAIMS)，可以提高從多電核肽段選擇性分離過濾單電荷肽段的能力，在非靶向蛋白質組中，單電荷肽段的濾除對于樣本中蛋白的定性和定量有一定影響。

目前的單細胞代謝組學技術主要利用檢測可培養微生物的代謝物組成，不能直接用于多細胞生物研究微生物與細胞間的相互作用。質譜成像(Mass spectrometry imaging, MSI)可以檢測組織中的代謝物和其他生物分子，在單細胞代謝領域有巨大的應用前景。

基于MSI技術基質輔助激光解吸電離(Matrix‐assisted laser desorption/ionization, MALDI)質譜也是目前最常用的單細胞代謝組研究的分析技術；樣品在進入質譜前與基質混合并用脈沖激光照射。MALDI-MS測量組織切片或載玻片上樣本不同點的代謝物，從而創建代謝物的空間圖譜；使用MALDI可以獲得空間分辨率低于5μm的質譜圖，這使得研究代謝物的分子分布更加可靠。與其他方法相比，MALDI-MS的樣本前處理簡單通量高，已用于單細胞生物體克隆群體中的異質性和組織中特異的微生物和細胞亞型研究；但MALDI存在代謝物覆蓋率低和電離效率低的缺陷。為了克服MSLDI低覆蓋率的缺陷，有科學家提出了一種基于不同電離度的多種基質的MSI方法，但該方法仍不能檢出低離子能的代謝物。開發的MALDI-2通過在第二個激光器產生的氣相激光羽流中啟動額外的電離增強分析物信號。

MSI技術的改進對提高細胞和亞細胞水平上不同代謝物產生了很大的影響，但MSI仍存在許多挑戰。MSI能獲得已知和未知代謝物的信號，軟件和數據庫的改進大大提高代謝物鑒定準確性。

2.11 應用多組學方法進行腫瘤微生物組研究
單一組學研究不足以全面理解與腫瘤微生物相關的更復雜的生物學過程，基于多種技術平臺的多組學技術成為強有力的研究工具。已有大量研究表明微生物產生的細胞毒性代謝物在腫瘤發生和發展過程中起重要作用，如糖酵解有氧和無氧途徑的重要中間物質丙酮醛(methylglyoxal, MGO)，也可以在甲基乙二醛合酶(methylglyoxal synthase)的作用下由微生物合成，MGO可以不通過酶解作用實現蛋白共價修飾，從而調節細胞代謝和轉錄相關的功能；此外，MGO可以通過與鳥嘌呤殘基反應誘導DNA和RNA損傷，也能破壞有絲分裂期間破壞染色體分離直接影響基因組的完整性。

此外，MGO還可以與蛋白的賴氨酸殘基反應形成糖基化產物(advanced glycation end products, AGEs)，進而影響細胞功能并導致炎癥的發生。MGO作為一種糖化試劑，可導致代謝紊亂、表觀遺傳的改變和核小體不穩定；MGO還可以影響轉錄因子活性并改變基因轉錄，引起細胞應激因子的積累。組蛋白MGO糖基化的兩階段模型表明，低劑量的MGO可以通過促進轉錄而利于癌細胞的增殖，但過量的MGO可導致染色質交聯，弱化轉錄并導致細胞死亡。

通過化學蛋白質組學技術的研究表明，高濃度MGO可通過誘導染色質中的組蛋白-組蛋白和組蛋白-DNA交聯損傷其動力學特征；基于MGO糖基化的化學探針在MGO糖基化追蹤、富集等方面有較好的應用前景，對潛在生化功能的理解也有一定的促進作用。由此可知，MGO能在基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組水平上調節腫瘤的發生和發展（圖6），對MGO的研究也進一步表明，單一組學不足以全面了解這些蛋白質在生物學研究中的作用。
 

圖6. 多組學應用促進相互關聯學科的綜合研究

3.未來展望
腫瘤微生物在腫瘤發生、發展和治療過程中起著重要的作用；微生物、腫瘤細胞和免疫細胞之間的相互作用對腫瘤微環境有較大的影響。免疫細胞不僅影響微生物與抗癌療法，而且能直接調節腫瘤發展過程中的微生物。因此，微生物治療與免疫治療相結合有望成為癌癥治療有效方法。多組學技術已經用于腫瘤微環境中的腫瘤細胞和微生物標志物研究，極大地促進了新診斷和治療策略的發展。盡管組學技術在腫瘤領域取得了許多進展，但該領域的研究仍處于起步階段，單細胞蛋白質組學和代謝組學技術在腫瘤微生物研究中很大程度上仍然是理論性的；此外，腫瘤微生物組多組學研究缺乏統一的標準流程。

本文系統總結了腫瘤微生物組研究的多組學方法及個方法的優缺點。盡管存在著腫瘤內微生物含量低且TME異質性高等問題，但單細胞多組學的發展必將克服這些難題，成為腫瘤微生物組研究中最有力的工具。