各個環節高效提高NK細胞純度的方法介紹
NK細胞無需抗原預先致敏，即可快速反應并同時激活免疫系統來協同發揮殺傷作用，堪稱免疫細胞里的航空母艦。科學家對NK細胞療法也寄予厚望，全球的NK細胞相關療法也在如火如荼的進行著。如何高效利用NK細胞幫助我們戰勝疾病，科學家們為此一直在努力著，今天我們就來系統的了解一下如何在各個環節提高NK細胞的純度，以達到最好的治療效果。
Fig1：NK 細胞的來源
首先我們需要了解NK細胞是一種自然免疫細胞，廣泛存在于人體的外周血、骨髓、脾、淋巴結等組織中。在細胞來源方面，外周血中的NK細胞含量較高，是常用的來源之一【1】，另外臍帶血產業在近幾年迅速發展，也成為NK細胞主要來源之一。除此之外，也可以從人體骨髓、脾、淋巴結等組織中獲得NK細胞，但這些來源的細胞數較少，需要經過特殊處理才能得到足夠的細胞量。
01 血樣采集和處理
首先，需要從健康人體中采集血樣進行實驗。為了避免血液的凝固和失活，建議在血樣采集后盡快進行處理。外周血采集建議首選肝素鈉采血管，最好在采血后4小時內安排分離實驗。而采集臍血無法選用采血管，必須用采血袋，建議使用抗凝劑較少的采血袋（比如100ml的袋子內含14ml抗凝保存液），以更大程度防止血鈣流失。血液處理可以使用Ficoll梯度離心分離法（以外周血為例），具體方法如下：
Fig2：梯度離心分離法
1、將采集的外周血室溫下進行離心處理（操作前請進行檢菌），離心15分鐘，離心速度設置為750g左右。此時，血液將被分為兩個層次：上層為血漿，下層為白細胞、紅細胞和粘稠物。
2、自體血漿分離
2.1 操作1離心結束后用移液管將上層血漿轉入離心管進行密封滅活（血漿放入水浴鍋56℃滅活半小時），滅活后的血漿置于4℃冰箱半小時，防止補體、血小板等對細胞活化產生影響；
2.2 取出冰箱血漿進行再次離心，離心10分鐘，離心速度1000g左右，取上清作為自體血漿置于4℃冰箱備實驗需用。
3、單個核細胞PBMC分離
3.1 操作1離心結束后獲得的血細胞沉淀用等體積生理鹽水重懸混勻，然后將混勻的血細胞緩慢加入到離心管中Ficoll層上（確保分層清晰）；
3.2 將離心管放入離心機進行離心處理，離心25分鐘，離心速度930g左右，離心結束后棄去上清并吸取白膜層細胞（盡量吸盡液面交界處的細胞層）
3.3 吸取到的白膜層細胞放入新的離心管，用生理鹽水重懸混勻定容至100mL并進行離心處理，離心8分鐘，離心速度750g；
3.4 可再次洗滌細胞。棄上清，重懸細胞，吸取少量細胞計數。調整細胞密度后種瓶。
02 刺激激活
為了提高NK細胞的殺傷活性，需要在細胞培養基中添加一些刺激劑，如IL-2、IL-15等。IL-2和IL-15的加入可以促進NK細胞的增殖和分化，同時提高細胞的殺傷活性。在激活NK細胞時，我們將其培養在含有IL-2和IL-15的培養基中，以促進細胞的增殖和活化。不過值得注意的是，從PBMCs誘導培養也會刺激CD3+ T和NKT（CD3+CD56+）細胞的擴增。因此，基于異體移植可能引起的T細胞介導的同種異體反應性，可以考慮提前通過磁分選消除其他免疫細胞，以便培養可以獲得高純度的NK細胞，這也是CAR-NK細胞制備獲得高純度細胞的關鍵。
實驗內容如下：
1、完全培養基配置：1L培養基加入IL-2，終濃度為 1000IU/mL。
2、細胞計數：用少量完全培養基重懸細胞（PBMCs），吸取少量細胞計數。調整細胞密度1.5-2×106 個/mL。
3、種瓶：將細胞懸液中加入激活因子和滅活血漿，轉入培養瓶內，培養終體積約 25mL(為了更有效刺激NK細胞激活，可提前采用包被液包被培養瓶)。
4、將培養瓶放入37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，在培養期間每隔一天補充一次培養基。
5、培養7天后，我們將細胞懸液轉移到培養袋繼續培養。
當NK細胞被激活時，檢測的維度是多樣的，可以檢測活性、殺傷毒性等等，常見的方法有以下三種：
1.流式細胞術（Flow cytometry）：流式細胞術是一種常用的檢測方法，可以通過檢測表面標記物和內部蛋白來確定細胞類型和功能。通過使用特定的抗體，可以檢測到激活的NK細胞表面上的活化標記物，如CD16、CD56、和CD137等。
2.細胞活性測定（Cellular cytotoxicity assay）：細胞活性測定可以評估NK細胞的殺傷能力。在這種測試中，將被測細胞與腫瘤細胞共同培養，然后測量腫瘤細胞的死亡率。如果激活的NK細胞對腫瘤細胞有殺傷作用，那么腫瘤細胞死亡率將會升高【2】。
3．酶聯免疫吸附測定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：ELISA可以檢測細胞因子和其他蛋白質的表達水平。在NK細胞激活的情況下，細胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等會被分泌出來。通過檢測這些分泌的細胞因子水平，可以評估NK細胞的激活狀態。
Fig3：NK細胞毒性測定
03 擴增階段
在完成刺激激活之后，NK細胞需要進行擴增培養，以增加其數量和活性，以便進行后續的實驗和應用。在培養NK細胞時，我們需要選擇合適的培養基和培養條件，以促進細胞的生長和分化。最常用的培養基是無血清免疫細胞培養基，其中包含必需氨基酸、維生素和微量元素等營養物質。此外，還可以添加一些生長因子，如白細胞介素-2（IL-2），以促進NK細胞的生長和擴增。在一些研究中，還會添加一些其他的細胞因子，如白細胞介素-12（IL-12）、白細胞介素-15（IL-15）、白細胞介素-18（IL-18）、白細胞介素-21（IL-21）等，以提高NK細胞的細胞毒性和殺傷作用。
其中IL-2在短時間內可促進NK細胞的存活、并激活提高細胞毒性。主要由于IL-2刺激PBMCs可導致淋巴因子激活的殺傷細胞LAK數量增加（LAK前體細胞是由NK細胞和T細胞組成），因此對自體腫瘤細胞具有較高的殺傷能力；其次IL-2和IL-15聯合應用可促進NK細胞的增殖和活性，更有利于NK細胞的激活，特別的是IL-2和IL-15聯用可誘導NK細胞活化受體NKG2D、NKp44、NKp30和NKp46的表達，提高其對腫瘤細胞株的細胞毒性；研究表明IL-12也可用于體外NK細胞培養，刺激NK細胞產生IFN-γ；另外IL-12、IL-15和IL-18聯合可以誘導細胞因子誘導的記憶樣NK細胞（CIML），CIML是一種壽命長、細胞毒性高、分泌IFN-γ的細胞。CIML-NK細胞已在小鼠腫瘤模型中進行過繼免疫治療，并顯示出抗黑色素瘤和淋巴瘤的良好效果；白細胞介素-21是一種四螺旋束的細胞因子，對淋巴細胞和骨髓細胞具有多種生物學效應，能誘導NK細胞的成熟，并增強其細胞毒性，并且IL-21與IL-2或IL-15組合能誘導NK細胞的增殖，對NK 細胞產生調節作用。
在擴增培養過程中，我們還需要注意一些關鍵的指標，如細胞密度、細胞存活率和細胞表面標志物的表達情況等。通常，NK細胞的最佳擴增密度為1-2×106/mL。為了保證細胞的生長和分化，我們需要每2-3天補充新的培養基，并添加適量的生長因子和自體血漿。除了培養基、生長因子和自體血漿之外，還需要注意細胞培養的溫度、濕度和二氧化碳濃度等條件。NK細胞的最佳培養條件為37℃、5% 二氧化碳。在擴增培養過程中，我們還需要檢測細胞的活性和表面標志物的表達情況，以確保細胞的質量和適用性。最常用的檢測方法是流式細胞術，通過特定的熒光標記物和抗體，可以對細胞表面標志物的表達情況進行檢測和分析。
結語：科學家們為了在魚龍混雜的體系之中提純出NK細胞進行了數十年的研究，我們從上文的方法可以看出各種方法都存在自己的優越性以及局限性，這就需要我們學會理性分析自己的需求特點，選擇合適的提純方案，并在實踐中不斷優化和改進技術。我國的NK細胞療法起步雖然略慢，但是我們充分利用了產業模式以及廣納最新的科學技術，發展出許多NK細胞提純的平臺，為我國NK細胞相關研究和應用保駕護航。在疫情陰霾完全散去的今天，我國的免疫治療領域正如NK細胞本身一樣，在監管反應和協同方面同時發力，為戰勝疾病貢獻自己的力量。
參考文獻：
【1】Rossi F, Fredericks N, Snowden A, Allegrezza MJ, Moreno-Nieves UY. Next Generation Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2022 Jun 2;13:886429.
【2】 Kim J, Phan MT, Kweon S, Yu H, Park J, Kim KH, Hwang I, Han S, Kwon MJ, Cho D. A Flow Cytometry-Based Whole Blood Natural Killer Cell Cytotoxicity Assay Using Overnight Cytokine Activation. Front Immunol. 2020 Aug 14;11:1851.
【3】 Kim TJ, Kim M, Kim HM, Lim SA, Kim EO, Kim K, Song KH, Kim J, Kumar V, Yee C, Doh J, Lee KM. Homotypic NK cell-to-cell communication controls cytokine responsiveness of innate immune NK cells. Sci Rep. 2014 Dec 5;4:7157.
