代謝組學應用：普洱茶和茶褐素通過“菌-腸-肝-腦”軸緩解代謝綜合征
近日，云南農業大學食品科學技術學院龔加順教授團隊與上海百趣代謝組學技術研究中心團隊在Food Research International（IF=7.425）上發表了題為“Pu-erh Tea and Theabrownin Ameliorate Metabolic Syndrome in Mice via Potential Microbiota-Gut-Liver-Brain Interactions”的論文。
研究背景
代謝綜合征（Metabolic syndrome, MS）是一種代謝紊亂性疾病，會增加Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化和非酒精性脂肪肝等疾病的患病風險，約有四分之一的世界人口受此影響。 近年來，隨著MS發病率的增加及組學技術的發展，越來越多的研究表明MS的發生與腸道菌群密切相關，調整日常飲食能改變腸道菌群從而緩解代謝綜合征的發生。 普洱茶作為云南的一種傳統茶飲，被報道對調節晝夜節律和飲食誘導的代謝綜合征有一定效果。茶褐素作為普洱茶的重要組成成分之一，能通過升高血液中的高密度脂蛋白，降低血液中的總膽固醇、甘油三酯和低密度膽固醇等降低肝臟脂肪沉積。
此外，普洱茶和茶褐素被報道在緩解肥胖和胰島素抵抗及代謝綜合征方面有一定效果，如普洱茶能夠通過增加潛在有益菌群（雙歧桿菌和阿克曼菌等）的相對豐度，并降低潛在有害菌群（幽門螺桿菌）的相對豐度，重塑MS患者的糞便微生物群的失調；茶褐素能夠通過降低Firmicutes/Bacteroidetes比值、促進Bacteroides acidifaciens增加從而緩解代謝性疾病。 雖然目前已有普洱茶或茶褐素干預高脂飲食誘導小鼠肥胖或代謝綜合征的研究，但并沒有將腸道菌群、轉錄本或代謝等多個水平同時進行組合研究，而且對于普洱茶和茶褐素兩者在干預代謝綜合征方面的異同，仍缺乏研究。
本文以普洱茶（Pu-erh，縮寫為E）、茶褐素（theabrownin，縮寫為B）和二甲雙胍（metformin hydrochloride，縮寫為Y）分別干預正常飲食和高脂飲食條件下的正常小鼠（K）和代謝綜合征小鼠（MS，縮寫為M）為研究對象（K，KE，KB，KY，MS，ME，MB和MY），通過聯合16S rRNA擴增子測序、轉錄組、非靶標代謝組和靶標代謝組等技術平臺，研究茶褐素和普洱茶干預對小鼠生理生化指標、糞便腸道菌群和短鏈脂肪酸、肝臟轉錄本、血清和腦組織代謝物的影響，對其緩解代謝綜合征的潛在作用機制進行探究。
圖1. 研究內容要點
研究結果
1.普洱茶和茶褐素干預改善MS小鼠體重和炎癥及衰老等指標的變化干預期間，K組和K各干預組間及MS組和MS各干預組間小鼠的飲食量和飲水量無顯著變化，但K組和K各干預組小鼠的體重和飲水量顯著低于MS組和MS各干預組。同時，ME組小鼠體重降低最多，但飲食量最多、飲水量較少。 與K組相比，MS組的胰腺重量顯著降低，肝臟和脂肪組織重量顯著升高，普洱茶和茶褐素干預能從一定程度上緩解MS引起的變化。此外，結合脂肪組織切片和脂滴面積，發現普洱茶在緩解體重增加和提高脂質代謝方面可能比茶褐素效果更好。
肝組織和空腸的病理切片表明普洱茶和茶褐素能有效緩解肝組織和空腸的損傷和炎癥的發生；肝組織炎癥指標（IL-1、IL-6和TNF-6），抗氧化指標（SOD和GSH），氧化指標（MDA）、胰島素INS和血糖glucose指標分析結果表明，MS組的炎癥指標顯著升高，而二甲酸胍和茶褐素能顯著地改善炎癥因子的異常；MDA在MS小鼠顯著升高，SOD和GSH在MS小鼠中顯著降低，二甲酸胍和茶褐素菌同樣能顯著地緩解這些指標的異常；INS在MS小鼠中顯著降低，glucose在MS小鼠中顯著升高，二甲酸胍和茶褐素能顯著改善INS的變化，但并不改變glucose的變化。綜上，茶褐素在改善MS相關的炎癥因子、氧化和抗氧化能力等指標方面可能比普洱茶效果更好。
圖2. 普洱茶和茶褐素干預對小鼠生理生化、炎癥及衰老指標的影響
2.普洱茶和茶褐素干預改善MS小鼠腸道菌群結構組成各組不同時間點的腸道菌群結果表明，小鼠在經歷正常飲食模式切換到高脂飲食模式后，菌群α多樣性出現降低，β多樣性出現升高。 從PCoA（principal co-ordinates analysis）圖能明顯看出不同干預對小鼠腸道菌群組成的變化軌跡，飲食模式切換對菌群的影響十分明顯。此外，各組不同時間點的菌群組成結果表明高脂飲食后，Firmicutes/Bacteroides，Proteobacteria和Verrucomicrobia顯著升高。
接下來，對實驗終點的菌群數據進行分析，與K組及其干預組相比，MS組及干預組小鼠有更低的Firmicutes和更高的與產脂多糖和炎癥相關菌Proteobacteria；MY組中的Bacteroides最高；KE組和KB組相對于K組α多樣性顯著增高，而MS組各干預組相對于MS組未發生顯著變化；從PCoA和NMDS（Non-Metric Multidimensional Scaling）分析明顯看出MS干預組更趨向于K，由此可看出普洱茶、茶褐素和二甲酸胍干預能夠調控改善MS小鼠腸道菌群。
為進一步探索與普洱茶和茶褐素干預相關的關鍵細菌，結合時間序列lmer分析、MetaStats和Wilcoxon統計結果，發現相對K組，K組各干預組中有3個顯著升高的細菌（Brevundimonas vesicularis, Veillonella parvula, Cutibacterium acnes ）和3個顯著降低的細菌（Blautia coccoides, Desulfovibrio sp UNSW3caefatS, Firmicutes bacterium ASF500）；此外，相對MS組，在MS干預組中有抗炎作用的產短酸菌Clostridiales bacterium42_27和有抗炎和抗增重效果的Firmicutes bacterium ASF500顯著升高。
PICRUSt功能分析表明，普洱茶和茶褐素干預的MS小鼠組中，腸道菌群的功能層面上無顯著影響，但普洱茶和茶褐素干預的K小鼠組中，腸道菌群參與的氨基酸和脂質代謝功能發生明顯變化。 綜上，普洱茶和茶褐素能夠通過調控腸道菌群進而減少炎癥從而緩解代謝綜合征，而且普洱茶和茶褐素對正常小鼠和代謝綜合征小鼠的腸道菌群的調控是有差異的，表明對代謝綜合征進行菌群調節的時候需要考慮飲食背景。
圖3. 普洱茶和茶褐素干預對小鼠腸道菌群的影響
3.普洱茶和茶褐素干預影響MS小鼠肝臟節律基因表達為進一步探究普洱茶和茶褐素干預代謝綜合征MS小鼠的潛在分子作用機制，對小鼠肝臟進行轉錄組學檢測分析，累計發現5252個差異基因；對差異基因進行SPIA（Signaling-pathway impact analysis）通路富集分析發現，節律基因相關的通路在普洱茶和茶褐素干預小鼠肝臟中呈現顯著變化，其中Npas2, Clock, Arntl和Cry1等節律基因在MS組及普洱茶和茶褐素干預MS組中均發生顯著變化。 相對普洱茶干預MS小鼠，茶褐素干預會影響調控更多與節律基因通路相關的基因（如Npas2, Clock, Arntl, Cry1, Per3, Per2和Bhlhe40等）。
圖4. 普洱茶和茶褐素干預對小鼠肝臟基因表達的影響
4.普洱茶和茶褐素干預影響MS小鼠血清和腦組織脂質代謝對小鼠的血清和腦組織進行LC-MS/MS非靶標代謝學檢測，發現K組，MS組及各自干預組的血清和腦組織樣本中代謝輪廓譜出現顯著變化，從血清和腦組織代謝組數據中分別找到259個和149個差異代謝物。 差異代謝物的MetPA（ Metabolomics Pathway Analysis）通路分析表明，普洱茶和茶褐素可顯著調節正常小鼠血清和腦組織甘油磷脂代謝和亞油酸代謝；普洱茶可顯著干預MS小鼠血清中的甘油磷脂代謝和亞油酸代謝，而茶褐素的干預作用恰好相反，茶褐素顯著影響的是MS小鼠腦組織中甘油磷脂代謝和亞油酸代謝。此外，普洱茶、茶褐素和二甲雙胍還顯著影響了MS小鼠腦組織中的嘌呤代謝。
圖5. 普洱茶和茶褐素干預對小鼠血清和腦組織代謝的影響05關聯分析探索研究普洱茶和茶褐素干預緩解MS的潛在機制
為進一步探索潛在作用機制，首先以差異腸道細菌、差異肝臟基因、差異血清和腦組織代謝物進行rdcv-PLS（partial least square-discriminant analysis incorporated into a repeated double cross-validations framework）關聯分析，以|皮爾森相關系數|>0.6為標準，篩選出了19個腸道細菌，81個肝臟基因，71個血清和32個腦組織代謝物，從PCA（principal component analysis）圖可看出這些篩選出的關鍵指標能夠較好地區分各組。
與前面腸道菌群結果中發現的7個關鍵細菌進行取交集，可以發現，rdcv-PLS模型篩選出了6個關鍵細菌，在普洱茶和茶褐素干預MS小鼠中，這6個關鍵細菌（C. bacterium 42_27, F. bacterium ASF500, B. coccoides, B. vesicularis, C. acnes, D. sp. UNSW3caefatS）與肝臟節律基因（如npas2, nr1d1, cry2, per3, arntl等）有較強的關聯，且這些節律基因與脂質、氨基酸和嘌呤代謝相關的代謝物（如N, N-dimethylglycine, deoxyguanosine, deoxycholic acid(+), beta-guanidinopropionic acid, 12-hydroxydodecanoic acid等）顯著相關。
圖6. rdcv-PLS模型篩選出的關鍵變量
為研究關鍵細菌與基因和代謝物指標及炎癥和衰老指標的關系，接下來對上述篩選得到的各項關鍵指標進行spearman相關性分析。結果表明，MS和ME組中，C. acnes與腦組織代謝物decanoic acid顯著負相關，而與Clock、Npas2、MDA和IL-1正相關；C. bacterium 42_27與腦組織代謝物decanoic acid顯著正相關，與Clock顯著負相關。
MS和MB組中，F. bacterium ASF500與血清代謝物3-dehydroxycarnitine和腦組織代謝物decanoic acid及Slc16a3, MDA, and IL-6顯著負相關；與血清代謝物（如2-arachidonyl glycerol ether, 2-deoxyycastasterone, succinic acid semialdehyde），腦組織lysoPI（18:0/0:0）, Cry1, Cry2, Per2, Per3, Slc16a7,和INS顯著正相關；B. coccoides與Slc5a8, IL-6和TNF-α顯著負相關，與血清代謝物DG（18:3（9Z,12Z,15Z）/15:0/0:0），腦組織代謝物LysoPI（18:0/0:0），Per3, Olfr78和INS顯著正相關；C. bacterium 42_27與血清代謝物linoelaidic acid, Clock, Npas2和IL-1,與血清脂質PC（P-18:1（9Z）/16:1（9Z），2-arachidonyl glycerol ether, deoxycholic acid(-)和deoxycholic acid(+)顯著正相關。
因此，普洱茶和茶褐素干預MS小鼠中，腸道菌群可能通過影響肝臟節律基因、短酸轉運基因和短酸受體基因間的相互作用來調控改善代謝綜合征，推測短鏈脂肪酸代謝可能是普洱茶或茶褐素影響腸道菌群的潛在靶點。
為進一步驗證上述推測，對小鼠糞便樣本中的短鏈脂肪酸進行檢測；從分析結果發現，與肥胖相關的短鏈脂肪酸（acetic acid和propionic acid）和潛在有害短鏈脂肪酸（isobutyric acid和isovaleric acid）在普洱茶干預的MS小鼠組中顯著降低，在茶褐素干預的MS小鼠中非顯著降低。 綜上，茶褐素和普洱茶可能通過調節腸道菌群、短鏈脂肪酸代謝、血清和腦組織脂質代謝、肝臟中的炎癥和衰老因子及晝夜節律基因表達來有效緩解代謝綜合征。
圖7. 關鍵變量間的相關性及普洱茶和茶褐素干預對小鼠短鏈脂肪酸的影響
結論
本研究以高脂飲食誘導的代謝綜合征小鼠為研究對象，首次聯合多組學技術（16S rRNA測序、轉錄組、LC-MS/MS非靶標代謝組和GC-MS靶標代謝組等）對普洱茶和茶褐素緩解代謝綜合征的潛在機制進行探索，發現普洱茶和茶褐素可能通過“菌-腸-肝-腦”軸（腸道菌群-糞便短鏈脂肪酸代謝-血清和腦組織脂質代謝-肝臟炎癥和衰老因子及晝夜節律基因）來改善代謝綜合征；同時也發現了普洱茶和茶褐素干預在改善代謝綜合征的效果及潛在靶點上具有一定的差異。本研究結果為普洱茶益生菌相關產品的開發提供了理論依據，為普洱茶產業的發展提供了科技理論支撐。
