鼠尾膠原蛋白在細胞培養器皿的表面包被上的應用及三維膠原制備方法
膠原蛋白是結締組織和內臟器官細胞外基質的主要構造成分，在皮膚、肌腱、骨骼中分布最為廣泛。從遺傳和結構上膠原蛋白分為許多類型。
膠原蛋白I（Collagen, Type I）是由2個α1 鏈和1個α2 鏈組成的異源多聚體（圖1），在37℃，中性pH 下自發形成三螺旋骨架，是一種優秀的細胞培養用基質，廣泛用于肝細胞、成纖維細胞、脊神經節、肌肉細胞、施萬細胞、胚肺細胞、上皮細胞和其他大量細胞系。還能用于研究細胞生長、分化、遷移以及發育過程中的組織形態發生。
圖1 膠原蛋白I分子模型
鼠尾膠原蛋白I 是根據Birkedal-Hansen 方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備。可用于包被細胞培養器皿，培養細胞表面粘附性，特別適合那些在普通培養器皿表面不易貼壁的細胞，比如成纖維細胞、肝細胞等原代細胞。還可用于三維膠的制備，模擬真實的生長環境，使得細胞在三維環境中生長。
組織培養器皿的表面包被推薦濃度為1-5μg/cm2，起始濃度可首選5μg/cm2。建議根據具體細胞類型來優化。
本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的無菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建議用6mM HAc溶液做進一步稀釋。配制方法：取34.5μl 冰醋酸（17.4M）加入100ml雙蒸水，充分混勻后即得到6mM HAc溶液，0.22μm濾膜過濾除菌后待用。
1）根據自身實驗體系以及優化后的包被濃度來計算所需的膠原蛋白量，并加入相應孔內，確保膠原蛋白溶液完全覆蓋表面。
a. 以包被濃度為 5μg/cm2，先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如50μg/ml， 然后參考表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表來加量到各孔內；
b. 以包被濃度為 2μg/cm2，先用6mM HAc稀釋液將膠原蛋白（5mg/ml）稀釋到合適的中間濃度，如12μg/ml，然后參考表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表來加量到各孔內；
表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表
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培養器皿 |
表面積（cm2,每孔或每皿） |
當包被濃度：2ug/cm2，中間稀釋濃度12ug/ml，加入該稀釋液體積（ul） |
當包被濃度：5ug/cm2，中間稀釋濃度50ug/ml，加入該稀釋液體積（ul） |
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96孔細胞培養板 |
0.3 |
50 |
30 |
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24孔細胞培養板 |
1.9 |
300 |
190 |
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12孔細胞培養板 |
3.8 |
600 |
380 |
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6孔細胞培養板 |
9.5 |
1580 |
950 |
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35mm細胞培養皿 |
8 |
1330 |
800 |
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60mm細胞培養皿 |
21 |
3500 |
2100 |
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100mm細胞培養皿 |
55 |
9170 |
5500 |
2）室溫孵育1h，小心吸掉多余液體，用無菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完膠原蛋白溶液后，在超凈臺內開蓋過夜晾干。無菌條件下，包被好的器皿在4-25°C至少可保存3個月。
當鼠尾膠原蛋白I使用濃度>1mg/ml，pH 7.0左右皆可形成具有一定強度的三維膠，建議成膠濃度為1-2 mg/ml。
由于本品是以溶于6mM HAc的無菌溶液形式提供，在成膠過程需先加入0.06倍體積的0.1M NaOH中和。
10×細胞培養液（依據培養的細胞種類而定）、0.1M NaOH、無菌水
1）取200μl膠原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的離心管內，加入690μl無菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH【注：該步驟不能反，如果反過來把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結】，立即混勻。再加入100μl 10×細胞培養液，混勻后立即加到培養器皿中。【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試】。
2）將培養器皿在室溫（25°C左右）放置20min待膠凝固后，轉移到培養箱內。
三維膠原制備（含細胞）（以配制1ml，1mg/ml三維膠為例）：
a. 準備好細胞懸液，并放置于冰浴中。b，將200μl膠原蛋白（5mg/ml）加到12μl 0.1M NaOH【注：該步驟不能反，如果反過來把12μl 0.1M NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結】，立即混勻。再加入23μl 10×細胞培養液，立即混勻【注：混勻后pH為7.0左右，如果培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試】。再加入760μl 的細胞懸浮液，混勻后立即加到培養器皿中。
b. 將培養器皿在室溫（25°C左右）放置20min待膠凝固后，加入適當體積細胞培養液，轉移到培養箱中培養。
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