由于共洗脫雜質的存在，對固相多肽合成法（SPPS）合成的親水性肽——組蛋白H3（1-20）的純化是一個艱巨的挑戰。在這個分享案例中，我們展示了如何通過使用PurePep EasyClean （PEC）多肽純化試劑盒和反向高效液相色譜法（RP-HPLC）進行正交肽純化來提高肽的純度和降低純化過程中的溶劑消耗。

引言
肽相關的一些雜質存在，會顯著影響藥物研發的結果（例如假陽性結果），為保證臨床級肽的高質量性和結果測定的高可靠性，有必要將這些雜質從活性藥物成分中去除。

化學合成肽的純化主要是通過傳統的色譜方法進行，RP-HPLC是最常用的方法。此外，快速色譜法（flash）也是研究級肽純化的通用方法。然而，這兩種色譜技術可能會都會忽略共洗脫雜質的存在。

相比之下，Gyros Protein Technologies公司的正交純化PurePep EasyClean（PEC）技術與傳統色譜法不同，它基于化學選擇性分離原理。首先在固相多肽合成（SPPS）過程最后添加無痕可裂解連接子（PEC-Linker）對全長目標肽進行修飾，而SPPS過程中的封端（Capping）確保了只有全長目標肽可以添加上PEC-linker，然后通過正交捕獲和釋放技術（catch-and-release）直接將目標肽從復雜的混合物中分離出來。

在這個案例中，我們通過使用PEC多肽純化試劑盒（基礎裝）純化組蛋白H3（1-20）肽的極性片段，并且驗證了PEC和RP-HPLC的正交性。

討論
PEC級肽
從圖1（左）的色譜圖來看，粗組蛋白H3（1-20）看起來似乎很純凈，但是一些缺失序列相應的峰卻在質譜圖中集中大量出現。其中主要的雜質是丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）和蘇氨酸（Thr）缺失的序列。用0.1％HFBA進行HPLC分析顯示出了潛在的峰，并且測定了粗品的純度為29％。
 

圖1（右）顯示了PEC純化肽的色譜圖。仔細觀察比較質譜圖（右側圖1中的插圖）發現PEC單次純化有效地去除了共洗脫雜質，從而確保了分析結果的高可靠性。

由于七氟丁酸酐（HFBA）能夠將目標肽從截短的序列中分離出來，因此利用HFBA增強的反向快速色譜法（flash）進行首次純化并與PEC純化進行比較。采用該方法后，粗品純度只提高到了66％（表2）。而使用PEC多肽純化試劑盒純化之后，純度達到了86％。

利用PEC獲得臨床級肽
接下來，我們利用RP-HPLC進行對上述兩種方式純化的肽進行二次純化，以獲得臨床級肽。純度分別從29％（粗品）提高到了85％和96％（表2）。由此可見，PEC在與RP-HPLC的正交組合純化肽中表現出了非常優異的純化效率。


節省溶劑消耗

色譜分離會消耗大量的有機溶劑，減少溶劑的使用是改善肽純化生態足跡的關鍵點。

ACN的消耗量是評估正交法生態效益的合理指標。由于PEC的捕捉和釋放（catch-and-release）原理，純化肽只需要使用少量的有機溶劑，并且產生的廢物更少。在整個肽純化過程中，僅積累了50 ml 的ACN和200 ml 的總廢料。

而快速色譜法（flash）純化則需要500 ml 的ACN，并且產生總計1500 ml 廢料。相比之下，PEC純化從整體上節省了85％以上的溶劑使用并大量減少廢料生成。

當考慮結合RP-HPLC進行二次純化時，額外需要添加1000 ml 的ACN并且總廢料生成增加了3000 ml。

總體來看，正交PEC純化與RP-HPLC法結合，可以節省約30％的昂貴溶劑消耗并且大大減少有害廢料的產生。

結果
1 PEC純化可以在單個正交純化步驟中可以有效去除共洗脫截斷序列

2 正交PEC和RP-HPLC結合獲得了具有挑戰性的超高純度的肽
3 通過正交PEC純化，可節省高達85％的溶劑使用并大量減少總廢料生成