外泌體的功能、應用熱點及分離純化方法
一、我是誰？
外泌體是由所有細胞釋放的一類胞外囊泡，比細胞小很多，大小范圍為40—150nm。與細胞類似，外泌體由脂質雙分子層膜構成，膜上含有各種標志性蛋白，可用于外泌體的鑒定和分離。內含物中包含特定蛋白質、RNA（mRNA、miRNA、IncRNA等）和DNA，其中miRNA的占比最多。外泌體除了存在于血漿、血清、尿液、腦脊液等人體體液中，還存在各種組織中，可以說外泌體在人體中無處不在。
圖1 外泌體的組成
二、我的功能有哪些？
外泌體的功能取決于它們與受體細胞相互作用的能力，并將它們的蛋白質、脂質和核酸傳遞到這些細胞。與靶細胞結合的特異性取決于粘附分子，如整合素。外泌體參與多種功能如調節基因轉錄翻譯、細胞增殖與凋亡、轉移與侵襲、血管生產、免疫應答、細胞分化、代謝調控、病毒免疫-------功能決定應用，外泌體的應用主要在疾病治療、生物標志物、藥物遞送等三大領域。
圖2 外泌體的功能
三、我的應用熱點有哪些？
圖3 外泌體的發展歷程
自從2013年外泌體領域科學家獲得諾貝爾生理或醫學獎，外泌體研究熱度高居不下。2019年外泌體基礎性研究經費超過2億，大量高質量文章涌現。其中在臨床癌癥研究中，一篇發表于2021年的文章表明外泌體PKM能傳遞NSCLC4療耐藥性，缺氧誘導下順鉑耐藥肺癌細胞通過外泌體PKM2向敏感細胞傳遞耐藥性。在體外診斷應用中，有研究表明外泌體能夠作為腫瘤診斷和分類的可靠標志物，可為不同類型的腫瘤的早期檢測提供新視角。在心血管疾病應用中，移植的心肌球來源的細胞（CDCs）分泌可使細胞恢復年輕的外泌體，年輕的CDCs通過調節心臟基因表達、心臟功能、運動能力等方面使年老動物恢復青春。那么在免疫學研究中，有研究報道指出：多發性硬化（MS）患者中的循環外泌體可通過let-7i靶向生長因子1受體（IGF1R）和轉化生長因子β1（TGFBR1）等來抑制Treg細胞，從而調節MS的發病機理。同時由于外泌體極好的生物相容性及具有保護性的脂質雙分子層囊泡，所以外泌體又被廣泛應用于藥物遞送載體領域。
圖4 外泌體應用領域
圖5 外泌體在癌癥中的應用
圖6 外泌體在心血管疾病中的應用
圖7 外泌體在免疫學中應用
四、我的研究方案是什么？
圖8 外泌體研究思路
談到外泌體的研究，就不得不提到外泌體的純化，外泌體分離純化方法主要有以下幾種：
1）超速離心法：具有不同密度和尺寸的顆粒在離心力作用下表現出不同的沉積速度。是目前外泌體分離純化的“金標準”。2）密度梯度離心：在介質中離心后試管中的物體可以保持在密度相似的介質位置。
3）超濾法：采用具有不同分子量截止點的超濾膜來選擇性分離樣品，在外泌體研究中經常輔助分離。
4）尺寸排除色譜：加入多孔材料后物質按其粒徑洗脫，大顆粒洗脫較早。
5）沉淀法：操作簡單、快捷，外泌體回收率較高。
6）免疫捕獲法：基于外泌體標記物和固定化抗體（配體）之間的特異性結合。
7）親和離心柱：外泌體與膜親和結合，利用洗脫液洗脫。
那么對于提取的外泌體，如何評價它的提取質量呢？目前業界主要通過以下方法來評價外泌體的質量：
1）Western Blot檢測特異性囊泡（如CD81、CD63）2）NTA檢測囊泡粒徑分布。
對于外泌體的內含物核酸研究，主要是通過qPCR或者NGS測序來進行研究。
