非靶代謝組學及腸道菌群測序在改善乳腺癌相關性疲勞研究中的應用
文章標題：Acupuncture ameliorates breast cancer-related fatigue by regulating the gut microbiota-gut-brain axis
發表期刊：Frontiers in Endocrinology
影響因子：6.055
作者單位：河南中醫藥大學第一附屬醫院
百趣生物提供服務：發現代謝組學Classic-親水版+腸道菌群測序
研究背景
癌癥相關疲勞（CRF）是癌癥治療后最常見的不良反應。CRF在乳腺癌（BC）存活者中比其他癌癥存活者更為常見。研究發現，接受化療治療的患者CRF發生率為70%-100%，且患者的疲勞程度明顯比未接受化療的患者嚴重。化療可以通過破壞生理屏障的通透性來激活外周促炎細胞因子并引起中樞神經系統炎癥，而生理屏障的滲透性反過來又會導致下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能障礙，最終導致CRF。而緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白（occludin）和緊密連接跨膜蛋白-5（claudin-5）可以調節細胞通透性，維持緊密連接結構和屏障功能。大量研究表明，HPA軸的皮質醇（CORT）、促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）和促腎上腺皮質素（ACTH）變化在疲勞發展中起著重要作用。此外，針灸可以通過干擾腸腦軸的各個方面來調節腸道微生物群的紊亂，恢復體內平衡。所以，作者研究了乳腺癌化療后CRF小鼠模型中針灸對疲勞行為、腸道菌群、腸道炎癥、神經炎癥反應、腸道屏障和HPA軸的影響及血清代謝物的變化，以闡述針灸治療的抗疲勞機制。
材料和方法
1 動物和細胞
40只6-8周齡SPF BALB/c雌性小鼠，適應性喂養1周。4T1熒光素酶小鼠乳腺癌細胞，置于RPMI-1640培養基進行培養。
2 分組和建模
采用隨機分組法，將40只雌性小鼠隨機分為4組（n=10/組）：（1）Control組，正常喂養，不做任何干預；（2）Model組，采用皮下腫瘤移植和環磷酰胺化療治療（CTX）；（3）Acu組，在成功建模后，所有小鼠在相應的治療點接受針灸治療；（4）Sham組，在相應治療點附近的非穴位刺激小鼠。
3 實驗
做強迫游泳（FST）及露天試驗（OFT）用于疲勞行為驗證，并取小鼠腸道內容物、腸道組織、海馬組織及血清樣本用于16S、WB、ELASA及血清代謝物等相關檢測。
研究結果
1 針灸對乳腺癌BC化療后的抗疲勞作用
首先使用FST和OFT實驗來探索各組小鼠在腫瘤化療和針灸干預后的疲勞行為。結果顯示，與對照組相比，模型組強迫游泳不動時間增加（圖2C）。在OFT實驗中，模型組的總行駛距離和在中心區域花費的時間都有所減少（圖2D、E）。與模型組相比，針灸組強迫游泳的不動時間顯著減少（圖2C），總行駛距離和在中心區域花費的時間顯著增加（圖2D、E），而假針灸組和模型組在FST和OFT方面沒有差異。同時，與假針灸組相比，針灸組的強迫游泳不動時間也顯著縮短，總行駛距離和在中心區域花費的時間顯著增加（圖2C-E）。這些數據表明，針灸治療對BC化療后的CRF小鼠具有抗疲勞作用。
2 針灸治療調節BC化療后CRF小鼠腸道菌群的物種豐度
作者使用16S rRNA測序檢測了癌癥相關疲勞小鼠化療后腸道微生物群的變化。結果表明，對照組的香農指數和辛普森指數顯著高于模型組和假針灸組，同時，針灸組的香農指數和辛普森指數也顯著增加（圖3A、B）。PCoA結果表明，模型組、假針灸組的樣本與對照組完全分離，且針灸組的樣本與對照組的樣本比較接近（圖3C）。上述結果表明，癌癥相關疲勞（CRF）小鼠化療后腸道菌群的菌群豐富度、多樣性和物種差異發生了顯著變化，針灸治療可以有效逆轉這種變化。
3 針灸治療改善BC化療后CRF小鼠的腸道屏障、腸道炎癥及神經炎癥
在作者的研究中發現，與模型組和假針灸組相比，針灸組緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白和緊密連接跨膜蛋白-5等蛋白表達水平顯著升高（圖4A、B）。另外，與對照組相比，CRF顯著提高了腸道（圖4C、D）和海馬（圖4E、F）中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達水平，并且三種促炎因子水平在針灸治療后均被顯著抑制（圖4C-F）。結果表明，針灸治療可以改善乳腺癌小鼠BC化療后的腸道屏障功能，降低腸道和海馬炎癥反應。
4 針灸治療改善小鼠BC化療后HPA軸功能障礙
本研究采用ELISA檢測血清中HPA軸相關因子的蛋白質含量變化。研究表明，與對照組相比，模型組中CRH和CORT水平顯著降低，ACTH水平升高。與模型組相比，針灸組CRH和CORT表達水平升高，ACTH表達則受到抑制。且假針灸組和模型組的CRH、CORT和ACTH水平沒有顯著變化（圖5A-C）。結果表明，針灸療法通過改善HPA軸功能障礙發揮抗疲勞作用。
5 針灸治療對BC化療后CRF小鼠血清代謝產物及代謝途徑的影響
基于LC-MS非靶技術分析各組血清代謝物變化。結果表明，PCA分析未顯示比較顯著的組間差異（圖6A）。OPLS-DA得分圖顯示，模型組中代謝物與對照組中明顯不同（圖6B），針灸組中代謝物與模型組、假針灸組也存在顯著差異（圖6C、D）。同時各組之間有良好的模型擬合性和可預測性（圖6E-G）。此外，作者結合火山圖分析發現，與模型組、假針灸組相比，針灸組顯著上調的代謝產物比顯著下調的代謝產物多。（圖6H、I）。
隨后作者進一步篩選出8種主要的差異代謝物，針灸組血清中紅藻膠、N-甲基煙酰胺、4-羥基-1吲哚-3-乙腈、β-甘油磷酸、乙酸香葉酯、氧化苯乙烯、5-羥色胺和乙酰腎上腺素的水平高于模型組和假針灸組，這些主要差異代謝物在對照組中也高度表達（圖6J）。此外，作者使用KEGG數據庫分析了差異代謝相關代謝途徑，發現苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、苯丙氨酸代謝和β-丙氨酸代謝是針灸治療后的主要差異代謝途徑。總的來說，針灸治療可以調節BC癌癥相關疲勞小鼠在BC化療后的血清代謝物和代謝途徑變化。
6 腸道菌群與腸道屏障、腸道和海馬炎癥、HPA軸及血清代謝物的相關性分析
最后，作者使用Spearman分析方法分析了模型組和對照組之間主要的差異菌群和腸道屏障、腸道炎癥、神經炎癥、HPA軸功能變化及血清差異代謝物的相關性。結果顯示，伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌與腸道緊密連接蛋白、CORT和CRH呈負相關，而乳酸桿菌和未分類梭狀芽孢桿菌-UCG-014與腸道緊密連接蛋白、CORT和CRH呈正相關。鏈球菌、大腸桿菌志賀氏菌、伯克霍爾德菌與炎癥因子、ACTH呈正相關，而乳酸菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014與炎癥因子、ACTH呈負相關（圖7B-D）。此外，乳酸桿菌、分節絲狀菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014與8種差異代謝物呈正相關，而伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌與8種差異代謝物呈負相關（圖7E）。
研究結論
研究結果表明，針灸治療可以通過調節腸道菌群，改善腸道屏障和HPA軸功能障礙，抑制腸道炎癥和神經炎癥反應，從而調節乳腺癌化療后CRF小鼠模型的腸道微生態平衡和血清代謝物變化，緩解疲勞癥狀。以上結果表明，針灸治療的抗疲勞機制可能與腸道微生物群-腸-腦軸密切相關。此外，本研究為乳腺癌化療后癌癥相關疲勞CRF的基礎和臨床研究提供了新的參考。
發表期刊：Frontiers in Endocrinology
影響因子：6.055
作者單位：河南中醫藥大學第一附屬醫院
百趣生物提供服務：發現代謝組學Classic-親水版+腸道菌群測序
研究背景
癌癥相關疲勞（CRF）是癌癥治療后最常見的不良反應。CRF在乳腺癌（BC）存活者中比其他癌癥存活者更為常見。研究發現，接受化療治療的患者CRF發生率為70%-100%，且患者的疲勞程度明顯比未接受化療的患者嚴重。化療可以通過破壞生理屏障的通透性來激活外周促炎細胞因子并引起中樞神經系統炎癥，而生理屏障的滲透性反過來又會導致下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能障礙，最終導致CRF。而緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白（occludin）和緊密連接跨膜蛋白-5（claudin-5）可以調節細胞通透性，維持緊密連接結構和屏障功能。大量研究表明，HPA軸的皮質醇（CORT）、促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）和促腎上腺皮質素（ACTH）變化在疲勞發展中起著重要作用。此外，針灸可以通過干擾腸腦軸的各個方面來調節腸道微生物群的紊亂，恢復體內平衡。所以，作者研究了乳腺癌化療后CRF小鼠模型中針灸對疲勞行為、腸道菌群、腸道炎癥、神經炎癥反應、腸道屏障和HPA軸的影響及血清代謝物的變化，以闡述針灸治療的抗疲勞機制。
材料和方法
1 動物和細胞
40只6-8周齡SPF BALB/c雌性小鼠，適應性喂養1周。4T1熒光素酶小鼠乳腺癌細胞，置于RPMI-1640培養基進行培養。
2 分組和建模
采用隨機分組法，將40只雌性小鼠隨機分為4組（n=10/組）：（1）Control組，正常喂養，不做任何干預；（2）Model組，采用皮下腫瘤移植和環磷酰胺化療治療（CTX）；（3）Acu組，在成功建模后，所有小鼠在相應的治療點接受針灸治療；（4）Sham組，在相應治療點附近的非穴位刺激小鼠。
3 實驗
做強迫游泳（FST）及露天試驗（OFT）用于疲勞行為驗證，并取小鼠腸道內容物、腸道組織、海馬組織及血清樣本用于16S、WB、ELASA及血清代謝物等相關檢測。
圖1. 實驗設計
研究結果
1 針灸對乳腺癌BC化療后的抗疲勞作用
首先使用FST和OFT實驗來探索各組小鼠在腫瘤化療和針灸干預后的疲勞行為。結果顯示，與對照組相比，模型組強迫游泳不動時間增加（圖2C）。在OFT實驗中，模型組的總行駛距離和在中心區域花費的時間都有所減少（圖2D、E）。與模型組相比，針灸組強迫游泳的不動時間顯著減少（圖2C），總行駛距離和在中心區域花費的時間顯著增加（圖2D、E），而假針灸組和模型組在FST和OFT方面沒有差異。同時，與假針灸組相比，針灸組的強迫游泳不動時間也顯著縮短，總行駛距離和在中心區域花費的時間顯著增加（圖2C-E）。這些數據表明，針灸治療對BC化療后的CRF小鼠具有抗疲勞作用。
圖2. 針灸對乳腺癌BC化療后的抗疲勞作用
2 針灸治療調節BC化療后CRF小鼠腸道菌群的物種豐度
作者使用16S rRNA測序檢測了癌癥相關疲勞小鼠化療后腸道微生物群的變化。結果表明，對照組的香農指數和辛普森指數顯著高于模型組和假針灸組，同時，針灸組的香農指數和辛普森指數也顯著增加（圖3A、B）。PCoA結果表明，模型組、假針灸組的樣本與對照組完全分離，且針灸組的樣本與對照組的樣本比較接近（圖3C）。上述結果表明，癌癥相關疲勞（CRF）小鼠化療后腸道菌群的菌群豐富度、多樣性和物種差異發生了顯著變化，針灸治療可以有效逆轉這種變化。
圖3. 針灸治療調節BC化療后CRF小鼠腸道菌群的物種豐度
隨后作者在門屬水平上統計了每組相對豐度前30名的物種，并繪制了豐度直方圖。可看出在門水平上，與對照組相比，模型組和假針灸組的變形桿菌豐度顯著增加，擬桿菌和髕骨細菌豐度明顯降低。與模型組和假針灸組相比，針灸組中厚壁菌、擬桿菌和髕骨細菌的豐度顯著增加，變形菌門的豐度明顯降低。在屬水平上，與對照組相比，模型組中的伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌和鏈球菌的豐度較高，而乳酸桿菌、未分類擬桿菌、分節絲狀菌和梭狀芽孢桿菌較低。與模型組和假針灸組相比，針灸組中的伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌的豐度有所下降，而乳酸桿菌，未分類擬桿菌、分節絲狀菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014的豐度則有所增加（圖3E）。根據LEfSe分析，acu組的乳酸桿菌豐度高于模型組和假針灸組（圖3F、G）。此外，根據物種豐度表，基于屬水平進行了組間顯著差異分析。作者發現針灸后乳酸桿菌水平顯著升高（圖3H、I）。以上結果表明，針灸治療可以改善BC相關疲勞小鼠化療后腸道菌群的失衡，增加有益細菌的含量。3 針灸治療改善BC化療后CRF小鼠的腸道屏障、腸道炎癥及神經炎癥
在作者的研究中發現，與模型組和假針灸組相比，針灸組緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白和緊密連接跨膜蛋白-5等蛋白表達水平顯著升高（圖4A、B）。另外，與對照組相比，CRF顯著提高了腸道（圖4C、D）和海馬（圖4E、F）中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達水平，并且三種促炎因子水平在針灸治療后均被顯著抑制（圖4C-F）。結果表明，針灸治療可以改善乳腺癌小鼠BC化療后的腸道屏障功能，降低腸道和海馬炎癥反應。
圖4. 針灸治療改善BC化療后CRF小鼠的腸道屏障、腸道炎癥及神經炎癥
4 針灸治療改善小鼠BC化療后HPA軸功能障礙
本研究采用ELISA檢測血清中HPA軸相關因子的蛋白質含量變化。研究表明，與對照組相比，模型組中CRH和CORT水平顯著降低，ACTH水平升高。與模型組相比，針灸組CRH和CORT表達水平升高，ACTH表達則受到抑制。且假針灸組和模型組的CRH、CORT和ACTH水平沒有顯著變化（圖5A-C）。結果表明，針灸療法通過改善HPA軸功能障礙發揮抗疲勞作用。
圖5. 針灸治療改善小鼠BC化療后HPA軸功能障礙
5 針灸治療對BC化療后CRF小鼠血清代謝產物及代謝途徑的影響
基于LC-MS非靶技術分析各組血清代謝物變化。結果表明，PCA分析未顯示比較顯著的組間差異（圖6A）。OPLS-DA得分圖顯示，模型組中代謝物與對照組中明顯不同（圖6B），針灸組中代謝物與模型組、假針灸組也存在顯著差異（圖6C、D）。同時各組之間有良好的模型擬合性和可預測性（圖6E-G）。此外，作者結合火山圖分析發現，與模型組、假針灸組相比，針灸組顯著上調的代謝產物比顯著下調的代謝產物多。（圖6H、I）。
隨后作者進一步篩選出8種主要的差異代謝物，針灸組血清中紅藻膠、N-甲基煙酰胺、4-羥基-1吲哚-3-乙腈、β-甘油磷酸、乙酸香葉酯、氧化苯乙烯、5-羥色胺和乙酰腎上腺素的水平高于模型組和假針灸組，這些主要差異代謝物在對照組中也高度表達（圖6J）。此外，作者使用KEGG數據庫分析了差異代謝相關代謝途徑，發現苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、苯丙氨酸代謝和β-丙氨酸代謝是針灸治療后的主要差異代謝途徑。總的來說，針灸治療可以調節BC癌癥相關疲勞小鼠在BC化療后的血清代謝物和代謝途徑變化。
圖6. 針灸治療對BC化療后CRF小鼠血清代謝產物及代謝途徑的影響
6 腸道菌群與腸道屏障、腸道和海馬炎癥、HPA軸及血清代謝物的相關性分析
最后，作者使用Spearman分析方法分析了模型組和對照組之間主要的差異菌群和腸道屏障、腸道炎癥、神經炎癥、HPA軸功能變化及血清差異代謝物的相關性。結果顯示，伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌與腸道緊密連接蛋白、CORT和CRH呈負相關，而乳酸桿菌和未分類梭狀芽孢桿菌-UCG-014與腸道緊密連接蛋白、CORT和CRH呈正相關。鏈球菌、大腸桿菌志賀氏菌、伯克霍爾德菌與炎癥因子、ACTH呈正相關，而乳酸菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014與炎癥因子、ACTH呈負相關（圖7B-D）。此外，乳酸桿菌、分節絲狀菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014與8種差異代謝物呈正相關，而伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌與8種差異代謝物呈負相關（圖7E）。
圖7. 腸道菌群與腸道屏障、腸道和海馬炎癥、HPA軸及血清代謝物的相關性分析
研究結論
研究結果表明，針灸治療可以通過調節腸道菌群，改善腸道屏障和HPA軸功能障礙，抑制腸道炎癥和神經炎癥反應，從而調節乳腺癌化療后CRF小鼠模型的腸道微生態平衡和血清代謝物變化，緩解疲勞癥狀。以上結果表明，針灸治療的抗疲勞機制可能與腸道微生物群-腸-腦軸密切相關。此外，本研究為乳腺癌化療后癌癥相關疲勞CRF的基礎和臨床研究提供了新的參考。
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