Q1：線性mRNA各組件概念及功能?

A1：（1）5’-Cap：通常作為mRNA的起始結構，帽子結構可以使得mRNA進入體內以后開始翻譯，并維持mRNA的穩定性。
 

（2）UTR(Untranslated Regions)：即非翻譯區，是mRNA分子兩端的非編碼片段。5'-UTR從mRNA起點的甲基化鳥嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密碼子，3'-UTR從編碼區末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的前端。5'-UTR，可以提高mRNA在體內翻譯的效率；3'-UTR,可以提高mRNA的翻譯效率。
 

（3）CDS序列(Coding sequences)：一般可以在NCBI上查到，是與蛋白區域一一對應的序列，并且序列中間不存在其他與蛋白無關的序列，和真實情況最為接近。不同物種的CDS序列有一定的偏好性，因此，對CDS區域進行廣泛的篩選和設計顯得尤為關鍵，優化的CDS區域不僅可以提高mRNA的翻譯效率，同時修飾堿基的使用，可以進一步的降低mRNA在體內的免疫原性，增強藥物表現。開放閱讀框ORF(Open reading frame)它是理論上的蛋白編碼區，一般是先在序列中尋找起始密碼子(AUG)對應的序列ATG，然后按每3個堿基一組向后延伸，一直到出現終止密碼子(UAG、UGA、UAA)對應的序列。
 

（4）Poly(A)tail：進一步提高mRNA的穩定性，提高mRNA的翻譯效率。

Q2：環狀RNA中IRES結構及功能？

圖2 環狀mRNA結構示例

A2：IRES為核糖體的結合位點，該結構可啟動環狀mRNA的翻譯，它跟線性mRNA的帽結構類似。IRES避免了環狀mRNA必須添加昂貴的5’端帽子和繁瑣的Poly(A)尾巴。

Q3：環狀RNA環化的方式是什么？

A3：參考Anderson發表的文章，本公司環狀mRNA環化的方式是添加同源臂內含子自剪切方式。

Q4：線性mRNA中5種修飾堿基各有什么區別和作用？

A4：不同核苷酸修飾表現出不同的功能和作用,其中假尿苷修飾和甲基假尿苷修飾是應用最為廣泛的,具體選擇哪一種修飾應當根據實驗確定。
 

（1）Pseudo-UTP(Ψ)假尿苷：改變密碼子、增強轉錄本穩定性和應激反應應答。降低mRNA免疫原性,提高mRNA穩定性并增強其翻譯能力；
 

（2）N1-Methylpseudo-UTP(mΨ)甲基假尿苷：通過增加核糖體密度以elF2α依賴性和獨立機制增強翻譯,比假尿苷修飾更能降低mRNA免疫原性,并可增強mRNA的蛋白表達能力；
 

（3）N6-Methyl-ATP(m6A)：與mRNA穩定性、剪接加工以及microRNA 加工有關,可促進mRNA翻譯；
 

（4）5-Methyl-CTP(5mC)：5mC修飾連同多種效應酶,執行多種功能; 5mC的分布因細胞類型而異,在mRNA特定位置上的5mC修飾表現出不同的調控活性:它們可以促進或抑制翻譯；
 

（5）5-Methoxy-UTP(5moU)：可以降低所得mRNA的免疫原性,促進蛋白表達,對炎性巨噬細胞反應的誘導可忽略不計。

Q5：修飾堿基、帽結構一般推薦什么或者通用的是什么？

A5：我司一般用N1-甲基-假尿苷(N1-Methylpseudo-UTP)修飾堿基進行合成產品。通用帽結構采用的是Cap1 AG（化學共轉錄法加帽），客戶若有附加質控，我們可提供Cap ratio檢測。

 
Q6：Fluc mRNA表達的是什么熒光素？

A6：FLuc mRNA表達了一個最初從螢火蟲中提取的螢光素酶蛋白，可以催化螢火蟲螢光素D-Luciferin氧化成發光物質，發出黃綠色螢光。

Q7：Fluc-mRNA帶cy5熒光標記的，做實驗的時候需要避光嗎？

A7：最好將Fluc-mRNA進行避光實驗操作、避光保存，因為要防止熒光淬滅影響實驗結果。

Q8：mRNA保存條件是什么？

A8：需要低于-40°C保存，-80℃冰箱或液氮保存都可以，愛必信所提供的均為新鮮生產的產品，為了達到最佳使用效果，請在收到貨物的2個月內使用。若不小心將mRNA短期（例如1天）存放于-20℃，可以在正式實驗之前將mRNA跑瓊脂糖凝膠電泳看其是否降解。

Q9：mRNA未添加帽結構一般可以存放多久呢？

A9：mRNA添加了加帽結構我們建議可以-40℃保存2個月，未加帽的mRNA需要盡快使用，因為未添加帽結構的mRNA穩定性會降低，mRNA會受到核酸外切酶的降解。 

Q10：mRNA保存液主要有哪幾種？有什么區別？

A10：我司的mRNA保存溶劑主要有檸檬酸鈉鹽溶液和無核酸酶水兩種。檸檬酸鈉鹽溶液更適合動物體內的生理環境，如果是注射動物可以選擇用檸檬酸鈉鹽溶液保存mRNA；如果是mRNA做包裹后推薦使用無核酸酶水進行保存；如果是做細胞處理實驗，無核酸酶水及檸檬酸鈉鹽溶液都可以選擇，任選其一即可。

Q11：工具RNA的溶劑是什么？

A11：我司的工具mRNA通用溶劑一般是1mM檸檬酸鈉鹽溶液，pH為6.4。