一、線性化的目的
載體的主要作用是攜帶目的基因進入宿主細胞內，只有當載體處于線性化狀態時才能與外源目的基因完成重組，構建重組質粒。
與原核表達不同，在酵母表達中，用于轉化的質粒或載體上往往不含有酵母自身的復制源點，如果將環狀重組質粒直接轉入酵母細胞則不能穩定存在，所以必須進行線性化處理之后，以同源重組的方式整合到酵母染色體上，這樣目的基因才會在酵母細胞中穩定存在。
 
二、酵母體系常用載體
酵母載體類型包括酵母克隆載體、酵母表達載體以及酵母人工染色體(YAC)。
 
（1）酵母克隆載體：不含酵母啟動子，不能在酵母中表達外源基因，可分為兩類：
a. 酵母整合型質粒(yeast integrated plasmid. Yip): 帶有一個酵母URA3標志基因和大腸桿菌的復制和報告基因。由于質粒DNA與酵母基因組DNA之間發生了同源重組，在轉化的細胞中可以檢測到質粒的整合復制，轉化子穩定，但轉化率極低。
b. 酵母復制型質粒(Yeast replicable plasmid, Yrp): 該類載體在酵母中可以自我復制，主要有YRp, YEp和YCp
• 酵母復制質粒(YRp): 細茵質粒DNA+酵母遺傳標記+酵母復制序列(ARS)，可自主復制，但穩定性差；
• 酵母附加型質粒(YEp): 細菌質粒DNA+酵母標記基因+酵母2 μM質粒，游離于核外存在并自主復制，穩定性好。2μm質粒含有自主復制起始區(ori) 和STB區，STB序列能夠使質粒在供體細胞中維持穩定；
• 酵母著絲粒質粒(YCp): 該載體除含復制起點外，還有酵母菌染色體著絲粒(CEN), 因而能在染色體外自我復制，拷貝數低但很穩定，適合作亞克隆載體和構建酵母菌基因組DNA文庫。
YIp: 帶有一個酵母標志基因；
YRp: 在YIp的基礎上添加酵母復制序列(ARS)；
YEp: 在YIp的基礎上添加酵母2μM質粒。
 
（2）酵母表達載體：含酵母啟動子，酵母表達系統的載體一般是穿梭質粒，能在酵母菌和大腸桿菌中進行復制。
釀酒酵母表達系統中重組蛋白的生產可以使用三種類型的載體完成：整合質粒（YIp），附加型質粒（YEp）和著絲粒質粒（YCp）。在非常規酵母中，質粒選擇受到更多限制。雖然質粒可用于三種非常規酵母，但它們的拷貝數往往較低，并且易突變。因此，基因組整合仍是首選。
畢赤酵母表達系統中常用的包括分泌表達載體和非分泌型表達載體兩種：
a.畢赤酵母分泌表達載體
pPICZα A、B 和C 載體用于表達和分泌畢赤酵母中的重組蛋白，可用于任何畢赤酵母菌株，包括X-33、SMD1168H 和KM71H等。
pPICZα 載體包含以下元素：
• AOX1 啟動子，對相關基因進行嚴格調控，保證甲醇誘導表達；
• 用于重組蛋白分泌的α-因子分泌信號；
• Zeocin （博萊霉素）基因用于大腸桿菌和畢赤酵母中的篩選。
•含有c-myc 抗原決定簇和(6xHis) 標簽的C 端肽用于檢測和純化重組融合蛋白。
b.畢赤酵母非分泌型表達載體：
pGAPZ A, B, 和C 載體（2.9 Kb）使用GAP啟動子在畢赤酵母中穩定表達重組蛋白。GAP啟動子的重組蛋白表達水平略高于AOX1啟動子。與誘導型啟動子對比，組成型啟動子可以利用更多的碳源在畢赤酵母中表達外源蛋白。重組蛋白表達為帶有C端His標簽的融合蛋白。Zeocin的篩選標記可以同時使用于畢赤酵母和大腸桿菌。
 
（3）酵母人工染色體
酵母人工染色體（YAC），是一種能夠克隆長達400Kb的DNA片段的載體，含有酵母細胞中必需的端粒、著絲點和復制起始序列，是細胞內具有遺傳性質的物體，易被堿性染料染成深色，所以叫染色體。
特點：容量大（50-1000kb), 穩定性差。
作用：用于構建基因組文庫。
酵母中復制的必需元件包括自主復制序列（ARS）、用于有絲分裂和減數分裂功能的著絲粒（CEN）和兩個端粒（TEL）。
• 端粒重復序列（TEL）：定位于染色體末端一段序列，用于保護線狀的DNA 不被胞內的核酸酶降解，以形成穩定的結構；
• 著絲粒（CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中。在YAC 中起到保證一個細胞內只有一個人工染色體的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四條染色體的著絲粒；
• 自主復制序列（ARS）：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 進行雙向復制所必須的信號。
在YAC載體中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體，YAC載體以環狀的方式存在，并增加了普通大腸桿菌質粒載體的復制元件和選擇標記。
 
三、酵母系統載體選擇
酵母表達產物有胞內表達和分泌到胞外表達兩種方式，這取決于表達載體的選擇和構建是否帶有信號肽，可根據基因表達的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達載體。
① 胞內表達載體：主要包括 pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2 等。該類載體將目的基因表達在胞內，可避免酵母的糖基化，適合于通常在胞漿表達或不含-S-S-的非糖基化蛋白，較胞外分泌表達水平高但純化相對復雜。
② 分泌到胞外表達的載體：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P 等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，將外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號序列由 89 個氨基酸組成α交配因子的引導。
③ 多拷貝插入表達載體：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下，重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達量。
 
四、線性化驗證及結果解讀
線性化酵母前后跑對比電泳。切開后的條帶應該跑的慢（4-7），完整質粒跑在前面（1-3）。