非標準氨基酸作為雙生物正交處理一鍋制備蛋白質多綴合物
文獻信息
北京大學藥學院天然藥物仿生藥物國家重點實驗室和北京大學第一醫院團隊合作得研究成果“Noncanonical amino acids as doubly bio-orthogonal handles for one-pot preparation of protein multiconjugates(非標準氨基酸作為雙生物正交處理一鍋制備蛋白質多綴合物)”在學術期刊Nature Communications(影響因子17.694)發表。平生公司的小動物PET/CT(型號：Super Nova)產品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。
該研究的通訊作者為北京大學藥學院劉濤教授和北京大學第一醫院楊興教授。北京大學藥學院劉濤教授團隊博士后王永，碩士研究生韓伯陽以及北京大學第一醫院楊興教授團隊博士研究生張景明為該文的共同第一作者。團隊成員譚琳致，蔡文康，李雨軒，蘇曄宇，余宇彤，王昕，段小江，王浩宇以及天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室儀器平臺指導老師師曉萌，王靜，醫藥衛生分析中心儀器平臺指導老師鐘麗君等也為該研究做出了重要貢獻。該研究得到國家自然科學基金《多層次手性物質的精準構筑重大研究》，國家重點研發計劃合成生物學專項，北京大學臨床+X青年專項，以及北京市杰出青年基金等科研項目的大力支持。
文獻背景
治療性蛋白質，比如抗體，激素，干擾素，白細胞介素，酶等等在各類疾病治療領域發揮著重要的作用，但是這些天然蛋白由于成藥性的缺陷，如療效差，半衰期短，系統性用藥毒性大，免疫原性高等問題，難以滿足當前科研和臨床的需求。對蛋白質進行化學修飾逐漸成為一種重要的對其成藥性進行改造的手段。蛋白質的雙修飾或者多修飾在實現多功能蛋白藥物的開發方面變得尤為重要。
用于位點特異性蛋白質修飾的非匿名氨基酸(ncAA)的遺傳編碼已廣泛應用于許多生物學和治療應用。為了有效地制備均勻的蛋白質多綴合物，作者設計了兩種可編碼的非編碼氨基酸(ncAAs)，4-(6-(3-疊氮基丙基)-s-四嗪-3-基)苯丙氨酸(pTAF)和3-(6-(-3-疊氮基)-s-三嗪-3-基苯基)苯丙氨酸(mTAF)，它們包含相互正交和生物正交的疊氮和四嗪反應手柄。含有TAFs的重組蛋白和抗體片段可以以即插即用的方式與市售熒光團、放射性同位素、PEGs和藥物的組合在一鍋反應中容易地功能化，以提供蛋白雙綴合物，以評估小鼠模型中腫瘤診斷、圖像引導手術和靶向治療的組合。此外，作者證明，通過兩個無義密碼子將mTAF和含酮ncAA同時結合到一個蛋白質中，可以制備位點特異性的蛋白質三聯體。作者的結果表明，TAF是雙生物正交處理，可用于高效和可擴展的多復合物制備。
實驗方法
PET成像研究
64Cu標記的Fab-CY5-NOTA 22Rv1荷瘤小鼠(n=4)在100μL PBS緩沖液中靜脈注射3.70–4.44 MBq[64Cu]Fab-CY5-NOTA。在相應的成像時間之前，用2.5L/min的異氟烷麻醉小鼠，并將其放入micro-PET/CT掃描儀(Super Nova®，平生醫療科技有限公司)。在注射后1小時、6小時、12小時和24小時進行PET/CT成像。使用Avatar軟件分析圖像(版本1.6.6.5)使用3D OSEM+PSF算法重建PET數據。
實驗結果
作者用雙模態抗體片段評估了連續PET和熒光成像的效果(圖4b)。將攜帶22Rv1腫瘤的小鼠靜脈注射3.7–4.44 MBq 64Cu-J591Fab-CY5，并在不同時間點收集PET圖像。PSMA陽性的22Rv1腫瘤早在1小時p.i.就被特異性地觀察到，并在24小時p.i.內持續可見。然后，作者還進行了熒光成像和成像引導下的腫瘤切除術。在熒光圖像中清晰地觀察到22Rv1腫瘤，可以完全切除。在周圍正常組織中沒有觀察到明顯的熒光信號(圖4d)。用抗PSMA抗體對切除的腫瘤組織進行免疫熒光成像(圖4e)。
制備抗PSMA抗體片段雙綴合物，用于小鼠PSMA陽性腫瘤的顯微PET成像和熒光圖像引導手術。C注射64CuJ591Fab-CY5后不同時間點皮下22Rv1腫瘤的顯微PET成像(由白色虛線圓圈表示)。
文獻結論
總之，作者開發了一個方便、多功能的平臺，通過GCE將含有兩個相互正交和生物正交反應基團的ncAA進行位點特異性摻入，可以方便地獲得高產率的蛋白質雙重和多重綴合物。該平臺可以很容易地用于利用市售的蛋白質修飾試劑來擴展蛋白質的功能效用，從而使其成為研究將功能分子的各種組合附著到感興趣的蛋白質上的后果的經濟選擇。可以預期，該平臺對于擴大基于蛋白質的治療方法的范圍和產生治療方法(例如與抗體結合的各種藥物的組合)尤其有價值，這些藥物可以克服當前可用的免疫治療的局限性。
使用設備
Super Nova® Micro PET/CT（III 代外觀圖）
