辣椒作為一種常見的食品調(diào)味料，除直接食用或淺加工外，還可以提取辣椒素作為食品添加劑制作辣味食品。它還具有抗菌、鎮(zhèn)痛和助消化的特性，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥領(lǐng)域。
 

辣椒素的化學(xué)法合成都是以香草胺和8-甲基-6-壬烯酸作為反應(yīng)底物利用Schotten−Baumann反應(yīng)進行的。目前，其前體物質(zhì)香草胺都是通過貴金屬催化石油化工產(chǎn)品而得到的。然而，這種方法并不符合綠色化工的要求。



石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院張根林教授團隊在ACS Sustainable Chemistry & Engineering上發(fā)表了最新的研究成果“Yeast-Based Whole-Cell Factory for the Ecofriendly Synthesis of Vanillylamine as a Critical Step toward Capsaicin Production”。該研究團隊在解析香草胺生物合成途徑基礎(chǔ)上，構(gòu)建了以苯丙氨酸和酪氨酸為前體的香草胺酵母全合成體系。

 

研究人員利用酵母異源重組香草胺生物合成途徑得到香草胺的產(chǎn)率為6.47 g/L，然后通過上調(diào)莽草酸途徑來增強苯丙氨酸使香草胺的產(chǎn)量增了11%，進一步的通過重組的S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)循環(huán)優(yōu)化甲基轉(zhuǎn)移效率，使香草胺產(chǎn)量提高了84%，最后將酵母菌株從Z2切換到Z6，并重新連接了前體和SAM循環(huán)，在1L平行生物反應(yīng)器(迪必爾生物）上進行了測試，最終香草胺的產(chǎn)量提高到了14.89 g/L（125%），這是目前公開數(shù)據(jù)中的最高水平。

 

研究路線

 

一、釀酒酵母生產(chǎn)香草胺生物合成途徑的建立

 

為了構(gòu)建香草胺生產(chǎn)菌株，研究人員設(shè)計了兩個模塊：咖啡酰輔酶A合成模塊和香草胺合成模塊（圖2）
 

圖2 香草胺和辣椒素在工程酵母中的生物合成途徑

 

模塊1涉及前體咖啡酰基輔酶A的合成，需要四種酶的催化，包括苯丙氨酸銨裂解酶(PAL)、肉桂酸4-羥基酰化酶(C4H)、肉桂酰連接酶(4CL)和羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCT)。

 

研究人員在含有500 mg/L苯乙醇、0.18mg/L CAPE和49.9 mg/L對香豆酸的YPD培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵測試，通過HPLC - MS/MS檢測搖瓶發(fā)酵結(jié)果(圖3a)。出乎意料的是，在工程菌株Z1-1中檢測到2.94 mg/L阿魏酸(圖3a)。而阿魏酸理論上應(yīng)該由下一步的CAMT產(chǎn)生，這一發(fā)現(xiàn)暗示在Z1-1菌株中可能發(fā)生了一些未知的反應(yīng)。

 

模塊2涉及將咖啡酰輔酶A轉(zhuǎn)化為香草胺，并要求表達咖啡酰輔酶A-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶(CAMT)、阿魏酰輔酶A水合酶/裂解酶(FerB)和推測的轉(zhuǎn)氨酶(pAMT)。模塊2轉(zhuǎn)化過程中需要CAMT、 FerB和pAMT這三種酶。研究人員通過優(yōu)化得到了Z2菌株，接著在1L平行生物反應(yīng)器中利用分批補料培養(yǎng)的方式培養(yǎng)96 h后，Z2菌株產(chǎn)生6.47 g/L的香草胺(圖4b)，因此在釀酒酵母中首次實現(xiàn)了香草胺的從頭生物合成。并在Z2菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中檢測到肉桂酸(86.14 mg/L)和咖啡酸(2.36 mg/L)等中間產(chǎn)物(圖3a)，表明兩個模塊之間協(xié)同作用良好。
 

圖3 工程菌株在培養(yǎng)96 小時的中間產(chǎn)物分析

（a）96h時Z1-1和Z2菌株中間產(chǎn)物含量

（b）工程菌株補料批次發(fā)酵過程中OD₆₀₀與時間的關(guān)系

（c）96h時對工程菌株（Z2、Z3、Z4和Z5）中的酚酸進行定量分析

（d）96h時在所有測試菌株（Y1和Y2）的發(fā)酵液中檢測原兒茶酸。

（e）香草胺生產(chǎn)的推測途徑。

圖4 工程酵母合成香草胺

（a）采用高效液相色譜法對香草胺進行了定性分析。

（b）在96h時通過HPLC對香草胺的產(chǎn)生進行定量。

 

二、另一種香草胺的生物合成途徑的發(fā)現(xiàn)

 

研究人員發(fā)現(xiàn)在Z2菌株中中間產(chǎn)物較低，為了增加苯丙氨酸和酪氨酸的通量，將TAL、Aro9和PheA引入Z2菌株的δ1位點,構(gòu)建了Z3菌株。

 

對Z3菌株進行了發(fā)酵測試，測試條件為在初始葡萄糖濃度為2%的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，Z3菌株的香草胺產(chǎn)量為7.16 g/L，比Z2菌株增加了11%(圖4b)。但肉桂酸的積累明顯減少，Z3的肉桂酸積累量為18.91 mg/L，僅為Z2積累量的21%。

 

此外，還檢測到原兒茶酸、對羥基苯甲酸和香草酸三種新化合物，滴度分別為23.38mg/L、20.51mg/L和5.24 mg/L(圖3c)。

 

經(jīng)過一系列的研究測試，發(fā)現(xiàn)了另一條香草胺的生物合成途徑，通過增加苯丙氨酸和酪氨酸的供應(yīng)增加了香草胺的產(chǎn)量。

 

三、調(diào)節(jié)SAM生物合成來提高香草胺的生產(chǎn)

 

咖啡酰輔酶A轉(zhuǎn)化為阿魏酰輔酶A以及原兒茶酸轉(zhuǎn)化為香草酸都需要甲基化，其中SAM充當(dāng)甲基供體。研究人員采用兩種策略通過重構(gòu)SAM循環(huán)來提高甲基轉(zhuǎn)移效率。利用釀酒酵母的SAHase編碼基因（SahH）和擬南芥的MAT編碼基因（SAM2）共轉(zhuǎn)化到Z2或Z3菌株的rDNA整合位點分別構(gòu)建了Z4或Z6菌株。此外，將大腸桿菌的Mtn和LuxS與SAM2共轉(zhuǎn)化到Z2或Z3菌株，分別產(chǎn)生了Z5或Z7菌株。

 

接著研究人員將得到的Z4、Z5、Z6和Z7菌株在1L平行生物反應(yīng)器中進行了發(fā)酵測試，發(fā)酵條件為：溫度30°C，初始葡萄糖為20g/L，發(fā)酵24小時后每12小時進行一次補料操作，直到96小時發(fā)酵結(jié)束。在發(fā)酵過程中使用氫氧化鈉/硫酸控制pH保持在7.0。結(jié)果顯示，Z4和Z5菌株的香草胺滴度分別為9.21和11.88 g/L（圖4b），與工程Z2菌株相比，滴度分別提高了42%和84%。此外，在Z6和Z7菌株中分別檢測到14.89g/L和14.07g/L的香草胺，與Z2菌株相比增加了125%。

 

這些結(jié)果表明，這兩種策略都有效地改善了SAM作為甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的甲基供體的積累，從而促進了代謝途徑的平衡。

 

此外，他們也發(fā)現(xiàn)了與野生型酵母（CK）相比，所有工程菌株的生物量都有所減少（圖3b）。在發(fā)酵96小時后，Z4、Z5、Z6和Z7的生物量分別下降了25%、13%、10%和18%，積累的醋酸鹽分別達到了2.28g/L、3.03g/L、2.06g/L和2.95g/L。因此，可能的原因為香草胺和醋酸會抑制菌株的生長與活力。

 

四、在酵母細(xì)胞中通過香草胺的酯化實現(xiàn)了辣椒素的從頭合成。

 

在辣椒素合成酶(CS)的催化下，香草胺能與8-甲基-6-壬烯酰輔酶A酯化反應(yīng)生成辣椒素。在此基礎(chǔ)上，研究人員設(shè)計了模塊3，并在初始Z2菌株上構(gòu)建了C1菌株，在1L的平行反應(yīng)器上做了相應(yīng)的發(fā)酵測試，采用補料批次培養(yǎng)策略，發(fā)酵初始培養(yǎng)基葡萄糖濃度為20g/L,培養(yǎng)120h,辣椒素的產(chǎn)量為80.23μg/L（圖5）,因此實現(xiàn)了辣椒素在釀酒酵母細(xì)胞上的重頭合成。此外，在C1菌株中還檢測到142.46 g/L的8-甲基-6-壬烯酰輔酶A和6.02 g/L的香草胺。8-甲基-6-壬烯酰輔酶A供應(yīng)過慢可能會限制辣椒素的生產(chǎn)。

 

因此，增加8-甲基-6-壬烯基酰輔酶A的積累將是酵母生產(chǎn)辣椒素的潛在有益途徑。
 

圖5 工程酵母合成辣椒素

(a) 采用HPLC - MS/MS對辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品進行定性分析

(b) 采用HPLC - MS/MS對樣品進行定性分析

參考文獻 

Zhao, J. , Li, Y. , Yi, L. , Zhang, G. , & Ye, B. . (2023). Yeast-based whole-cell factory for the ecofriendly synthesis of vanillylamine as a critical step toward capsaicin production. ACS Sustainable Chemistry & Engineering.
 

平行生物反應(yīng)器

研究使用的1L生物反應(yīng)器屬于迪必爾生物的Minibox 系列平行生物反應(yīng)器。
 

圖6 Minibox 5  第5代平行生物反應(yīng)器

 

迪必爾平行生物反應(yīng)器從最初的minibox 1到minibox 5（圖6），再到2021年推出的顛覆性產(chǎn)品——CloudReady™️云生物反應(yīng)器（圖7），迪必爾一直致力于協(xié)助合成生物學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家進行科研與創(chuàng)新。CloudReady™️云生物反應(yīng)器整合了多種補料策略，同時產(chǎn)品軟件中內(nèi)置實驗設(shè)計（DoE）與分析軟件可以幫助用戶快速的進行布局實驗，縮短產(chǎn)品的開發(fā)周期。
 

圖7  CloudReady ™️云生物反應(yīng)器

 

D²MS軟件內(nèi)置3D Visual DoE可視化實驗設(shè)計：

· 可交互三維圖形展示實驗設(shè)計,使實驗設(shè)計不再抽象，富有趣味性。

· 內(nèi)置多項式回歸響應(yīng)曲面數(shù)據(jù)分析，使實驗設(shè)計到數(shù)據(jù)分析一氣呵成，提高效率，避免人為影響。

支持結(jié)果導(dǎo)出為CSV格式，支持第三方工具進行數(shù)據(jù)分析。