PCR實驗中常見問題與PCR擴增產物分析方法
PCR所有實驗結果都有成功或失敗，實驗的失敗可能是應該出結果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結果而出了結果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。下面對其詳細分析：
一、假陰性
出現假陰性結果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數量不過關以及PCR系統欠妥當；循環次數不夠。所以在實驗中出現假陰性失敗時，首先在原來擴增的產物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否準確，采集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。
二、假陽性
PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統中所擴增的產物是真實的。因為PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。
PCR擴增產物的分析法：
PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小，有助于擴增產物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產物外，還有助于產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發展的一系列產物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產物的精確分析。
1、凝膠電泳分析法
PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷后倒入電泳槽。
電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產物。
2、點雜交
當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩定和放射性危害，不能常規用于臨床或法醫檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩定性高，使用方便、安全、檢測速度快。
3、微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特異雜交使產物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區域雜交，漂洗后顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似于臨床常規應用的ELISA,適于臨床實驗室常規應用。
4、PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產物便于檢測。
一、假陰性
出現假陰性結果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設計不合理；提取的模板質量或數量不過關以及PCR系統欠妥當；循環次數不夠。所以在實驗中出現假陰性失敗時，首先在原來擴增的產物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環，一般都會獲得成功。如果沒有成功應檢查PCR擴增儀的溫度是否準確，采集標本是否有問題。為了防止假陰性的出現在選用Taq DNA聚合酶時，要注意用活力高質量好的酶。同時在提取PCR模板時，應特別注意防止污染抑制酶活性物質（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機試劑的污染。PCR擴增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補，尤其是要絕對保證引物的3′端與靶基因的互補。對變異較大的擴增對象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進行PCR操作時應注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應的各溫度點的設置要合理。
二、假陽性
PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言，而反應系統中所擴增的產物是真實的。因為PCR技術高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增，而造成結果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時要隔離不同操作區、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。
PCR擴增產物的分析法：
PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小，有助于擴增產物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產物外，還有助于產物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發展的一系列產物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產物的精確分析。
1、凝膠電泳分析法
PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷后倒入電泳槽。
電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產物。
2、點雜交
當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩定和放射性危害，不能常規用于臨床或法醫檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩定性高，使用方便、安全、檢測速度快。
3、微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特異雜交使產物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區域雜交，漂洗后顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似于臨床常規應用的ELISA,適于臨床實驗室常規應用。
4、PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產物便于檢測。
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