Q-TOF和生物信息學方法對食品中堅果過敏原綜合表征檢測詳解
食物過敏是一個全球性的健康問題，在過去的幾十年里，食物過敏的患病率一直在上升，影響著全球高達10%的兒童[1]，其中IgE介導的食物過敏表現最為常見，如急性蕁麻疹、哮喘以及一些危及生命的過敏反應[2]。迄今為止，食物過敏最好的治療方法就是避免食用致敏食物[3]。中國國家衛生健康委員會(NHC)起草的新版《預包裝食品標識通則》(GB7718)中已強制要求對商品中的過敏原進行標識。隨著經濟的快速發展和全球化，烘焙食品因其獨特的口感和營養成分在許多國家越來越受歡迎。出于口味和裝飾的目的，面包店通常都會使用牛奶、杏仁、腰果、花生和核桃等成分，這些成分都可能導致成人和兒童過敏[4]。因此，對烘焙食品中隱藏的痕量過敏原的分析方法的需求越來越大。
近日，來自南京市食品藥品監督檢驗院的凌睿院長團隊在FOOD QUALITY AND SAFETY（JIF Q1, IF=5.6）期刊上發表了文章“Comprehensive characterization and detection of nut allergens in bakery foods using Q–TOF mass spectrometry and bioinformatics”。本研究展示了一種新的方法，使用液質聯用技術同時檢測烘焙食品中來自杏仁、腰果、花生和核桃的特異性過敏原。質譜原始數據使用PEAK Studio Xpro軟件分析，然后篩選出候選多肽，通過MRM對其熱穩性和唯一性進行驗證。該方法對烘焙食品中痕量堅果過敏原的鑒定和定量具有一定的指導意義。
優化堅果蛋白的提取與酶切實驗條件
首先，為了有效地從原料和烘焙食品樣品中提取蛋白質，比較了不同緩沖液的提取效果以及不同酶切時間的影響。如圖1所示，緩沖液A (7M尿素，2M硫脲和4% CHAPS)提取堅果樣本后的蛋白質濃度明顯高于緩沖液B (200 mM Tris−HCl, pH 8.2, 2M尿素)。針對烘焙食品樣品，緩沖液C (50 mM Tris-HCl, pH=8.2)比緩沖液D (50 mM NH4HCO3, pH=9.0)更適合。Qi et al., 2019[5]也曾報道過，Tris-HCl緩沖液是烘焙食品中總蛋白提取的合適緩沖體系。如圖2所示，12 h消化時間足以產生較好的信號響應。
圖1 緩沖液對蛋白提取的影響
圖2 酶切時間梯度
候選肽段標志物篩選與MRM靶向驗證
杏仁、腰果、花生和核桃蛋白酶切后的肽段在Q-TOF EDR模式下進行DDA數據采集，產生的原始數據使用PEAKS Xpro軟件，結合de novo和數據庫搜索進行分析。結果，每個堅果樣本分別鑒定到155,80,306和177條多肽。基于-10logP打分，每個樣本選取Top 30的peptides作為候選多肽，然后通過NCBI植物蛋白質數據庫序列比對，排除一般面包店中會使用到的其他常見植物和動物成分的共有序列。最終，共保留了62條長度在11-22個氨基酸之間的多肽用于MRM靶向驗證（杏仁18條，腰果13條，花生15條，核桃16條）。在靶向結果中，選取每個堅果中響應信號最強且在其他樣本中無鑒定的4條特異性肽段，即共16條，每條肽段3個transitions（見表1）。
表1 四種堅果中發現的特征肽
制備堅果成分添加量分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/kg (mg總蛋白/kg空白基質)的梯度樣本，進行特征肽的MRM靶向驗證。如圖4所示，四種堅果樣本中，響應最高的信號肽的標準曲線R2都非常高，并且每條肽段的LOD和LOQ都與文獻報道一致[7-9]。另外，在空白基質中分別添加1、5、10 mg/kg的堅果蛋白時，對本分析方法對信號響應Top2的多肽來評估回收率。結果見表3，指定肽段的回收率在72.5% ~ 92.1%之間，相對標準偏差(RSD)小于5.2%。
圖4 信號肽標準曲線
表2 特征肽方法學驗證結果
表3 肽段回收率測定
在當地面包店購買了商品化的餅干和面包（各5批次）進行上述預處理和分析。結果見表4，除了餅干3和面包1之外，所有樣品中都檢測到杏仁的存在，但是餅干4、5和面包3、4和5的成分標簽上的過敏原信息區域并沒有相關標示，在其他三種堅果中也可以注意到類似的現象。對于這一現象，一個可能的原因是交叉污染[10]，因此這些檢測結果“陽性”的烘焙食品是可能對消費者的健康構成潛在威脅的，應該引起注意。此外，本研究采用正己烷去除堅果中的脂肪，這一過程也在一定程度上導致了脂溶性過敏原蛋白的損失，這一點有待于在未來的研究中進一步闡明。
表4 商品化面包和餅干特征肽檢測結果
本研究建立了一種結合高分辨質譜、生物信息學和三重四極桿質譜的烘焙食品中杏仁、腰果、花生和核桃過敏原的檢測方法。該方法檢測出了烘焙食品中未標示的過敏原，可作為烘焙食品生產企業的質量控制方法，減少在食品生產過程中無意中添加堅果過敏原的風險，促進產業升級。
參考文獻
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