在實驗中大家經常遇到這些問題：

1.通過各種在線軟件進行預測獲得miRNA靶向基因，但miRNA對靶基因的實際作用不清楚;

2.又或者預測到轉錄因子對基因的表達起抑制或增強的作用，而具體活性以及結合位點仍然需驗證;

3.lncRNA或者circRNA吸附miRNA效果如何還未知。

這個時候就需要用到熒光素酶(Luciferase)實驗。

熒光素(Luciferase)是自然界中能夠產生生物發光的酶的統稱，其中最有代表性的是來自螢火蟲體內(Firefly)和海腎(Renilla)體內的兩類螢光素酶，分別命名為F-Luciferase和R-Luciferase。

熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發出生物熒光(bioluminescence)，可通過熒光測定儀設備測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光，常應用于啟動子轉錄活性調控及miRNA靶基因驗證等方向研究。熒光素酶的具體應用，主要有以下兩個方面：

熒光素酶的應用

(一)：pGL3-Basic---用于轉錄因子結合位點與啟動子活性分析。

把待分析啟動子區段構建到F-Luciferase上游，和轉錄因子共轉染分析F-Luciferase活性即可反應啟動子的活性高低。該質粒通常需要結合持續性表達R-Luciferase的載體作為內參以校正不同樣品之間轉染的轉染效率。

啟動子的作用相當于“基因開關”，能夠控制基因表達的起始和表達。而啟動子的活性受轉錄因子的調節，轉錄因子是一種具有調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。一些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因分析(luciferase assay)是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。

將靶啟動子的特定片段插入到報告基因質粒中熒光素酶編碼序列的5’端，再與轉錄因子表達質粒共轉染細胞，加入特定的熒光素酶底物，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。結合定點突變等方法則可進一步確定轉錄因子與靶標啟動子的作用

(二)：psiCHECK2---miRNA與其靶點相關分析,包括miRNA靶基因驗證、lncRNA與circRNA吸附miRNA驗證等。

需要把miRNA潛在結合靶點克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR區域，然后與待測miRNA共同轉染細胞內測定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase (hLuc+)作為校正內參校正不同樣品之間轉染的轉染效率。

miRNA通常功能性作用于靶基因3’UTR，因此可以將目的基因mRNA3’UTR序列插入載體R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR區域， 通過比較miRNA引起的R-Luciferase活性高低來定量檢測miRNA對目的基因的抑制作用;結合定點突變等方法則可進一步確定miRNA對靶基因3’UTR的直接靶向序列。

熒光素酶已成為科研中運用最廣泛的報告基因之一，其具有檢測靈敏度高、結果重復性好、信噪比較高和易于檢測等特點。