小細胞外囊泡 (small extracellular vesicles, sEVs) 是細胞間通訊的重要介質，通過各種生物工程方法可以發揮它在治療方面的作用。多能干細胞 (pluripotent stem cells, PSC) 來源的sEVs作為一種潛在的再生醫學療法，在多種與衰老相關的退行性疾病中表現出巨大的臨床轉化潛力。針對當前人口老齡化嚴重的現狀，PSC-sEVs具有十分廣闊的臨床應用前景。然而，由于PSC-sEVs特異性表征手段的缺乏，阻礙了PSC-sEVs由基礎研究向工業化轉化的應用。

上海交通大學醫學院附屬第六人民醫院汪泱/李青教授團隊在國際細胞外囊泡學會 (International Society for Extracellular Vesicles, ISEV) 官方權威期刊《Journal of Extracellular Vesicles》發表了題為“Identification of specific markers for human pluripotent stem cell-derived small extracellular vesicles”的研究論文。該研究基于蛋白組學和納米流式分析技術，首次鑒定了一組PSC-sEVs特異性的蛋白標志物，為PSC-sEVs的標準化鑒定和質量控制提供了新的視角和強有力的手段。
 

01 PSC-sEV的蛋白質組學分析及驗證
胚胎干細胞 (embryonic stem cells, ESCs) 和誘導多能干細胞 (induced pluripotent stem cells, iPSCs) 均屬于PSCs。首先，該研究基于蛋白質組學分析分別對iPSC-sEVs和ESC-sEVs的蛋白組成進行了鑒定。如圖1所示，作者在鑒定到的5000多種蛋白質中，發現和選擇了7種高度富集的多能性相關蛋白，并結合Western Blot進行驗證。結果顯示（圖1g）其中六種蛋白 (PODXL、YB1、IFITM1、LIN28A、OCT4和Dnmt3A) 在不同多能干細胞來源的EVs中均明顯富集，具有作為多能干細胞sEVs標志物的潛力。
 

圖1.PSC-sEVs的蛋白質組分析

作者進一步對這些蛋白在 PSC-sEVs中的特異性表達進行了探究。通過對七種非多能干細胞 (293T、HFF1、huMSC、A549、H460、MCF7、MDA-MB-231) 來源的 sEVs進行分析，Western Blot結果發現LIN28A、OCT4、Dnmt3a在7種非PSC-EVs中不表達，YB1和IFITM1在4種非PSC-EVs中可檢測到。PODXL在MCF7-sEVs和MDA-MB-231-sEVs中均有檢測到，但條帶出現在與PSC-sEV 條帶不同的位置，PODXL也可用于有效區分PSC-sEVs與非PSC-sEVs。因此，這四種蛋白 (PODXL、OCT4、Dnmt3a、LIN28A) 被認為可用于PSC-sEVs的特異性鑒定和質量控制。

02 單PSC-sEV水平特異性標志物分析
由于EVs的高度異質性，作者采用納米流式檢測技術 (nano-flow cytometry, NanoFCM) 在單囊泡水平對標志物表達的特異性進行了驗證。作者以PSC和7種非PSC細胞來源的EVs為研究模型，考察了3種傳統標志物 (CD9、CD63和CD81) 、膜蛋白PODXL和表面糖脂SSEA4的表達情況。如圖2所示，這些表面標志物在不同細胞系來源sEVs的表達具有極強的異質性。CD9蛋白在的PSC-sEVs中陽性率可達到60%以上，而CD63和CD81的陽性率在PSC-sEVs與非PSC-sEVs之間沒有顯著差異。對于PSC-sEVs的特異性標志物PODXL和SSEA4在PSC-sEVs中的陽性率分別為50%和70%以上，而在非PSC-sEVs中陽性率僅在1%到18%之間，遠低于PSC-sEVs的表達比例。作者進一步利用熒光共聚焦顯微鏡對PODXL和SSEA4在sEVs上的表達情況進行了觀測，其結果顯示大多數PSC-sEVs呈現PODXL或SSEA4呈陽性，該結果與NanoFCM檢測結果相吻合。綜上，單囊泡水平的檢測分析進一步印證了PODXL和SSEA4可作為PSC-sEVs特異性標志物。
 

圖2. 不同細胞來源sEVs的多種表面標志物的NanoFCM檢測分析

03 密度梯度離心（DGUC）純化后的PSC-sEVs標志物驗證
由于基于超速離心的純化所得的EVs樣本中可能存在非囊泡組分的污染，作者進一步對樣品進行密度梯度離心純化。如圖3所示，PODXL、OCT4、Dnmt3a和LIN28A蛋白同樣在經由DGUC所得EVs樣本中被大量富集，該結果也證明了這些標志蛋白并非來自污染物。此外，NanoFCM分析結果也進一步表明DGUC純化所得sEVs的CD9、CD63、CD81、PODXL和SSEA4的陽性率均與UC所得EVs相似（圖3e-j），進一步排除了所鑒定的標志物來自污染物的可能性，以及不同純化方法導致的標志物差異的問題。
 

圖3.DGUC純化后sEVs樣品分析

綜上所述，該研究首次鑒定了一組 PSC-sEV 的特異性標志物，含PODXL、OCT4、Dnmt3a、 LIN28A、和SSEA4。這些標志物可用于PSC-sEVs的鑒定和質量控制，對于PSC-sEVs的臨床應用極具價值。

NanoFCM展望
基于干細胞EVs療法在疾病治療領域的研究與應用，NanoFCM憑借其卓越的散射和熒光檢測性能，在單顆粒外泌體水平實現了不同豐度的蛋白標志物分析，助力干細胞EVs特異性標志物表征，為干細胞EVs療法帶來新的見解和策略，將大大縮短分析時間，極大加快了干細胞EVs療法的基礎研究和臨床轉化進程。

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圖4.sEVs的免疫熒光染色