近年來，為更快地將創新療法帶給患者，加快藥物開發進程已成為生物制藥行業的主要關注點。重組中國倉鼠卵巢 （CHO） 細胞系是單克隆抗體 （mAb） 的主要表達系統，為了加快生物制藥進程，如何提高宿主細胞外源基因表達量及穩定性水平是個棘手的熱門話題，目前通常通過將遺傳信息隨機轉基因整合 （RTI：Random Transgene Integration）到宿主細胞基因組中產生，即通過選擇性標記進行多輪篩選以獲得具有高表達水平的克隆。而由于缺乏對隨機整合插入位點的控制，部分克隆細胞系的重組蛋白生產力可能會隨著時間的推移而減少，導致細胞系不穩定。因此，RTI代表了一種容易出錯且乏味的方法，導致開發時間很長。定點整合 （SSI：Site-Specific Integration） 被確定為 RTI的一種有前途的替代品，因為它可以更快速地生成高性能和穩定的生產細胞系，加速藥物開發進程。
 

基于RTI（上圖）與SSI（下圖）的細胞系開發過程圖示^[1]
 

在基于RTI的細胞系開發過程中，攜帶轉基因遺傳信息和選擇標記的線性化質粒穩定地整合到CHO宿主細胞的基因組中。因此，具有不可預測結構的多拷貝轉基因整合將發生在未知基因組位點上，代謝選擇后產生的細胞庫顯示出高水平的基因組和表型多樣性。對于基于SSI的CLD，能夠在基因組的特定位點精確插入或整合外源DNA片段，從而實現對特定基因的添加、刪除或替換，可使得細胞庫顯示出較低的表型異質性。相比于RTI，SSI具有高整合效率、外源基因可實現精確定位、基因表達具有一致性、減少位置效應使得基因表達受控、提高細胞株的安全性及簡化篩選流程等優勢。
 

常見的SSI技術方法

利用CRISPR-Cas9或其他變體，結合特異性向導RNA（sgRNA），在基因組中特定位置切割DNA，并通過同源重組修復（HDR）或非同源末端連接（NHEJ）插入外源DNA。

如Sleeping Beauty、piggyBac轉座子系統，通過轉座酶在特定位置插入外源基因。

如BxB1、Cre-LoxP、FLP-FRT和PhiC31等系統，通過特異性識別序列進行重組，實現外源DNA的整合。
 

Gaidukov L, Wroblewska L等人^[2]2018年發表于Nucleic Acids Research的文章，確定了21個支持轉基因穩定長期表達的新基因組位點，然后在選定的位點構建了包含一個、兩個或三個“著陸墊”重組位點的細胞系。通過在每個位點使用高效的BxB1重組酶以及不同的選擇標記，將重組酶介導的異源DNA插入到選定的位點，包括通過單次轉染靶向所有三個位點。使用這種方法可控地整合多達9個拷貝的單克隆抗體，代表21個轉錄單元中約100 kb的異源DNA。由于整合針對預先驗證的位點，重組蛋白表達在數周內保持穩定，并且整合有效載荷中抗體盒的額外拷貝導致抗體表達線性增加。總體而言，該多拷貝位點特異性整合平臺允許將大量DNA可控且可重復地插入穩定的基因組位點，在哺乳動物合成生物學、重組蛋白生產和生物制造方面具有廣泛的應用。

BxB1整合酶定點整合外源基因

Feary M, Moffat MA等人^[3]在2021年發表于Biotechnology Progress的文章， 將Fer1L4位點與CHOK1SV谷氨酰胺合成酶敲除 （GS-KO） 宿主相結合，創建了一個改進的CHOK1SV GS-KO 定點整合表達系統。CHOK1SV GS-KO SSI宿主是通過同源定向整合Fer1L4基因中不相容的Frt序列的靶向著陸墊創建的，靶向載體包含無啟動子GS表達盒和mAb表達盒，兩側是與宿主細胞系中著陸墊兩側的等效位點兼容的Frt 位點。
 

FLP/FRT重組酶定點整合外源基因圖示

Zhou M, Crawford Y等人^[4]在2021年發表于Biotechnology Progress的文章，利用Cre/Lox重組酶介導的盒式交換（RMCE）將表達抗體的盒引入預定位點，建立了CHO-K1-M衍生的SSI宿主細胞。兩個SSI宿主細胞都包含一個表達GFP的著陸墊，兩側是兩個不兼容的LoxP重組位點（L3和2L）。此外，在GFP著陸墊中插入了第三個不相容的LoxP位點（LoxFAS），以實現基于雙質粒的創新RMCE策略，其中兩個獨立的載體可以同時靶向單個位點。

Cre/Lox重組酶定點整合外源基因圖示
 

目前，已有一些知名制藥企業（武田制藥、羅氏、強生等）利用智能定點整合技術優化其生物藥物的生產流程，包括開發穩定細胞株用于大規模生產。而利用整合酶定點整合外源基因的方式對于國內制藥企業來說目前還是處于萌芽階段。但定點整合技術對抗體藥物開發帶來的前景是可預期的，眾多生物制藥企業一直期盼能盡快將定點整合應用于自身平臺中，加速細胞株的開發。
 

通過定點整合技術，將目標基因序列通過同源重組的方式轉染到已經通過前期篩選驗證過的活躍位點當中，構建均一細胞池。其首先需要構建平臺細胞，利用報告基因（如GFP 等） 篩選得到宿主細胞基因組中的高表達位點，之后利用重組酶的特異性，實現將目標產品基因插入在該表達量高、質量和表達量穩定的宿主細胞基因組位點，再利用Cytena克隆篩選單細胞打印系統，獲得穩定及高產的單克隆細胞株。

定點整合單克隆篩選流程

細胞類型：CHO-K1

細胞狀態：35%陽性率；80%活率

單細胞挑選設備：Cytena克隆篩選單細胞打印系統，對照組：FACS

單細胞、單克隆率：
 

 

通過無熒光轉化子同源同組，細胞樣品內有帶有熒光的母細胞也有無熒光即轉化子同組成功的目的細胞，12天后采用Cytena克隆篩選單細胞打印系統進行無熒光細胞鋪板（只分選非熒光的細胞），單細率約為85%，克隆恢復率約為20%，而對照組流式由于分選過程對單細胞狀態及活力造成損傷，后續單細胞難以恢復成克隆。此流程可以省去minipool與有限稀釋的環節，加快開發流程，值得一提的是，用定點整合方式，經單細胞打印系統分選獲得的單克隆，后續產量＞5g/L，約為隨機整合表達量的1.5-2倍，此流程可降低開發時間和成本，提升開發效能，大大縮短整個工藝開發及IND申報時間。

智能定點整合技術在單克隆細胞株篩選中具有高效、精確和安全等顯著優勢，當然其也面臨技術復雜、成本高以及潛在脫靶效應等挑戰，選擇使用SSI技術需綜合考慮實驗目的、成本和技術能力等因素。
 

[1] Schmieder V , Fieder J , Drerup R ,et al.Towards maximum acceleration of monoclonal antibody development: Leveraging transposase-mediated cell line generation to enable GMP manufacturing within 3 months using a stable pool[J].Journal of Biotechnology, 2022(349-):349.DOI:10.1016/j.jbiotec.2022.03.010.

[2] A multi-landing pad DNA integration platform for mammalian cell engineering. Nucleic Acids Res.Gaidukov L, Wroblewska L, Teague B, Nelson T, Zhang X, Liu Y, Jagtap K etc.(2018)

[3]CHOK1SV GS-KO SSI expression system: A combination of the Fer1L4 locus and glutamine synthetase selection. Biotechnol Prog.Feary M, Moffat MA, Casperson GF, Allen MJ, Young RJ.(2021)

[4]Development of a targeted integration Chinese hamster ovary host directly targeting either one or two vectors simultaneously to a single locus using the Cre/Lox recombinase-mediated cassette exchange system. Biotechnol Prog. Ng D, Zhou M, Zhan D, Yip S, Ko P, Yim M, etc.(2021)