與傳統的2D 細胞培養技術相比，3D 細胞球體提供了更多的仿生微環境， 在許多組織工程應用中已被證明是有價值的。盡管3D 細胞培養具有受益效應，但目前球體形成方法的可擴展性有限，對球體組織工程的臨床翻譯 提出了挑戰。雖然最近采用的液滴微流體可以提供一個連續的生產過程， 但使用油和表面活性劑，通常低通量，以及額外的生物制造步驟的要求阻 礙了球體培養的臨床翻譯。在這里，使用清潔(例如，無油和無表面活性劑) ，超高通量(例如，8.5 mL min-1,10000個球體 s-1) ，單步空氣微流控  生物制造球體形成區室化水凝膠。這種新技術可以可靠地生產一維纖維， 二維平面和三維體積劃分的水凝膠構造，其中每一個都允許空心球形成隔 室的明顯(一)各向同性取向。在噴墨生物打印分區水凝膠中產生的球體在成軟骨行為方面優于2D 細胞培養物。此外，細胞球體可以從劃分的水凝  膠中獲得，并用于以自下而上的方式構建形狀穩定的厘米大小的無生物材 料的活組織。因此，預計在空氣中微流體生產的球形分區水凝膠可以促進 生產和使用的細胞球體的各種生物醫學應用。

1. 引言
2D 體外細胞培養歷來是組織工程領域的  黃金標準，其目的是修復、再生或替換受 損的活組織。然而，傳統的2D 細胞培養  環境不像它們在體內的天然對應物，因此 對細胞行為產生不利影響。3D 細胞培養  , 如細胞球體或類器官已經允許一種更加 仿生的方法來進行細胞培養。[6-8]已經廣 泛報道，仿生3D 球體培養的細胞在用于  組織工程時優于2D 培養的細胞[9-13] ，并且可以促進更可靠的藥物靶標發現，并 使得具有改進功能的宏觀組織構建體的工 程。例如，載有干細胞球體的生物墨水的 3D 打印改善了生物制品構建體的功能行為(例如，成軟骨分化和軟骨基質沉積) 。 雖然有希望，但是諸如球體培養等3D培養技術的生產方法阻礙了它們的臨床翻譯 , 這些生產方法通常是批處理過程，擁有屬性較低。

這些批量生產技術如微孔[9,10,12,21-24]和懸掛滴[13,2 5-27]需要多個復雜和耗時的步驟，只能提供有限的球體產量 。盡管特定的生物反應器方法可以提高產量，但它們仍然局限于批處理過程，與微電池和懸掛液滴等隔離技術相比，這  些批處理過程通常對球體直徑的控制水平較低。 [28]雖然這  可能足以進行小型實驗室規模的實驗，但仍然需要具有高生  產率和高單分散性的強大的單步生物制造技術來促進臨床尺  寸組織的球體技術的臨床翻譯。 [29,30]微流體防火分區最近被研究用于將球體生產從批量生產過 程發展為連續生產過程。在中空生物材料隔室中的細胞微流  體封裝允許細胞球形成微生物反應器的控制連續生產，這提供了比傳統的批處理工藝更高的生產率。 [31-3提供了比傳統的批處理工藝更高的生產率。 [31-39]

然而，由于各種原因，傳統的片上微流控液滴發生器的設計阻礙了微流控液滴產生的球體在臨床上的廣泛應用。首先，傳統的芯片上微流體需要使用不可混溶的液體來形成液滴，這通常需要使用已知具有潛在危害并且常常與臨床應用不相容的油和表面活性劑。因此，產生的球體形成隔室需要大量清洗， 以試圖在培養/使用之前除去油和表面活性劑，這與耗時的手工過程有關，這對細胞活力有不利影響。[45,46]其次，雖然傳統的芯片上微流體允許連續的球體生產，但液滴形成通常僅限于滴 水狀態，導致低吞吐量(< 10μLmin-1)  ，這對于大多數臨床應用仍然不足。最后，從它們的隔室中回收球體以進行進一步的生物制造加工通常需要一個復雜的多步驟過程，這可能對細胞 存活產生不利影響。因此，仍然需要一種清潔、快速、細胞友好和單步生物制造策略，使大型工程組織具有原位球化形成特性。

在這里，我們介紹了一種新的空氣微流體(IAMF)[48]為基礎的生物打印技術，克服了球體使用的翻譯限制。具體來說， IAMF實現了包含無生物材料細胞的隔室的生物物質工程，這些隔室起到了球體形成微反應器的作用。有利的是，這種創新方法代表了用于以臨床相關速率(1-8.5 mL min-1相當于10000  個球體 s-1)產生高密度細胞球體的臨床尺寸水凝膠的工程的單 步生物制造技術。生產能力的顯著提高是由于 IAMF 能夠單分 散地賦予噴墨生物印刷油墨在噴射狀態下具有中空隔室，而傳 統的芯片上方法僅限于更慢的滴水狀態。這種新型的生物制造 過程也是非常清潔的，因為 IAMF 消除了傳統上對油，表面活性劑或犧牲模板的需要，以在工程組織內創建空心隔室。除了傳統的基于機器的噴墨生物打印之外，我們證明我們的內聯自下而上的生物制造也可以以簡單的手持設備的形式使用， 以手動打印具有多種復雜性的球體形成的分隔水凝膠，這進一步促進了該技術與臨床應用的兼容性。雖然微型組織的大規模生產 的翻譯挑戰對于過多的不同組織類型是重要的[28] ，但我們產生了臨床大小的軟骨組織作為模型組織，同時承認使用這種 方法也可以產生廣泛的其他(器官)形狀。

2. 結果和討論
2.1. 空氣微流體技術在分區水凝膠生物制備中的應用
IAMF 是一種微流體方法，通過在空氣中將液體射流與由壓電驅動的液體射流產生的恒定周期的水滴流碰撞，使得能夠以超高吞吐量產生無芯片、無油和細胞相容的單分散微粒。 [48]

在這項研究中，我們將 IAMF與噴墨生物打印相結合， 以允許空氣中形成的中空微膠囊的控制合并，從而能夠生產大規模的區室化水凝膠。為此，將兩個微噴嘴設置與可移動的 XYZ收集工作臺結合使用(圖1a)。

為了形成中空微膠囊，含有氯化鈣(CaCl 2)的核心微噴溶液  與通過使用壓電驅動將振動疊加到微噴嘴上而產生的受控液滴 系統相撞(圖1b)。具有降低表面張力(jcore  > jalgate)的海藻酸  鹽前體微噴的 Dropjet 聚結允許 Marangoni 驅動的封裝(圖1c)  。這種封裝過程發生在 je something (iμD4/阝j2)1/3的時間尺度上，i，D ，μ 和 j 分別表示微噴密度，直徑，粘度和表面張 力，通常在幾毫秒內。這使得在收集液滴之前的10-100毫秒的  液滴飛行時間內可以完全封裝。這使得能夠生產含有 CaCl2 核心和海藻酸鹽前體外殼的雙層液滴。由此產生的核殼(即海藻   酸鈣)化合物液滴通過從核心層向海藻酸鹽層擴散的 CaCl2  以內向外的方式交聯(圖1d)。由于離子海藻酸鹽交聯發生在毫秒范圍內[50]  ，并且由于交聯的內向外性質，當復合液滴仍然在空 氣中時， 內部海藻酸鹽層交聯，而外部海藻酸鹽層通過Ca2  +  離子的內向擴散隨時間發生交聯。然后通過可移動的XYZ 收集器或微噴臺以控制的方式收集部分交聯的微膠囊。

值得注意的是，撞擊的時刻是定時的，使得空氣形成的微囊的交聯仍然在進行中，使得它們在著陸時立即與微囊進行物理接觸，從而有效地形成包含空心微隔室的瞬時固體3D構建體(圖1e)。

我們假設通過使用標準的基于液滴的生物制造方法調整微膠囊放置，可以以強大的，可預測的和可控的方式形成1D纖維，2D 平面和3D體積的分區水凝膠(圖1f)。使用手持生物打印裝置(圖1g，h)證明了這種生物制造方法，其允許使用形狀穩定的區室化水凝膠手動直接填充缺陷(圖1i-k)。該手持方法預計將促進臨床應用，如在外科手術過程中的原位生物打印。 此外，我們證明了這種新型的生物制造方法也可以與可編程3D生物打印機(圖11，m)相結合，我們證明了允許生產由更復雜 的幾何形狀組成的大規模結構，如形狀穩定的管狀分區水凝膠 (圖1n，o 和電影 S1，支持信息)。IAMF 的超高通量性質(高達8.5 mL min-1)(圖 S1，支持信息)允許以快速，直接和單步 方式生物制造臨床尺寸的分區水凝膠(圖1p，q)。

由于 IAMF 產生的液滴的超高吞吐量和短的空中飛行時間，通常需要快速(毫秒)交聯策略，如所提出的海藻酸鹽離子交聯或光聚合。然而，依賴于較慢(幾秒鐘)交聯機制的材料，如絲素蛋白，仍然可以利用海藻酸鈉作為犧牲結構互穿網絡模板。