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由來自山東大學齊魯醫學院的 Ying Zhou，JingJing Ye以及ChunYan Ji等多名研究人員在期刊Adv Sci (Weinh)（IF=15.1）上，共同發表了題為“Silencing of IRF8 Mediated by m6A Modification Promotes the Progression of T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia”的文章。在該文章中，研究人員使用了購自AbMole的FB23-2（M9422）和 Actinomycin D（M4881）兩種產品，揭示了IRF8在T細胞急性淋巴細胞白血病（T-ALL）中的抑制作用，并闡明FTO通過調控IRF8的m6A甲基化修飾，從而介導T-ALL發病的具體機制，為T-ALL的研究提供了極具潛力的新策略。

T-ALL是一種侵襲性血液惡性腫瘤，并且預后較差。因此探究T-ALL的發生發展機制，尋找新的研究靶點，對攻克T-ALL具有重要的科學價值。

研究人員通過比較T-ALL患病受試者以及健康人之間的差異表達基因（DEGs），發現IRF8在T-ALL患病受試者中受到異常抑制（圖1A-B）。然后通過慢病毒轉染，在T-ALL細胞系Molt4和Jurkat中過表達IRF8，并進行CCK8和EdU檢測等實驗，發現上調IRF8能顯著抑制T-ALL細胞的生長（圖1C）以及侵襲遷移能力（圖1D-E）。

圖 1 A. 通過qRT-PCR檢測新診斷的T-ALL患病受試者和健康供體骨髓中IRF8的表達。B. 通過免疫印跡法檢測新診斷的T-ALL患病受試者和健康供體骨髓中IRF8的表達。C. 通過CCK8試驗分析IRF8表達的Molt4細胞、Jurkat細胞和NCs的增殖情況。D. 過表達IRF8的Molt4和Jurkat細胞，以及NC細胞在Matrigel基質膜下的結晶紫染色。E. 過表達IRF8的Molt4細胞和NC的侵襲和遷移能力。

接下來，研究人員通過構建Irf8敲除小鼠進行實驗（圖2A），結果顯示，Irf8-/-組小鼠的T-ALL發展具有高侵襲性，并且潛伏期更短，同時表現出明顯的肝脾腫大和股骨蒼白，說明存在白細胞增多、紅細胞減少和多器官浸潤等情況（圖2B）。此外，基因敲除小鼠骨髓GFP+細胞中Ki67水平升高，表明敲除Irf8能促進白血病細胞的增殖（圖2C），提示Irf8的缺失能與驅動基因協同作用，共同加速T-ALL發展。

圖 2 A. 建立T-ALL小鼠模型的程序。B. 移植了Irf8-/-和Irf8+/+脾細胞的小鼠在移植后兩周時的股骨、脾臟和肝臟圖像。C. 移植兩周后，Irf8-/-組和Irf8+/+組GFP+門控骨髓細胞的Ki67表達情況。

KEGG對DEGs的分析顯示，PI3K/AKT信號通路顯著富集（圖3A）。隨后選擇PI3K/AKT信號相關DEGs—PIK3R5（圖3B）進行進一步研究。免疫印跡（圖3C）和CCK8（圖3D）結果顯示，在IRF8過表達的Molt4細胞中，PIK3R5表達下調，AKT和mTOR的磷酸化水平降低。表明在T-ALL中，IRF8通過PIK3R5負調控PI3K/AKT通路。

圖 3 A. KEGG分析顯示，與陰性對照（NC）Molt4細胞相比，RNA-seq檢測到IRF8表達的Molt4細胞中PI3K/AKT通路富集。B. 熱圖顯示了IRF8表達的Molt4細胞（E1、F1、G1）和陰性對照（NC）Molt4細胞（E2、F2、G2）中與PI3K/AKT信號相關的DEGs。PIK3R5被確定為DEG。C. Irf8-/-和Irf8+/+ T-ALL小鼠脾臟中IRF8、PIK3R5和p-AKT表達的免疫熒光結果。D. PIK3R5過表達對Molt4-NC和Molt4-IRF8細胞活力的影響。

之后，研究人員使用Jaspar數據庫，在PIK3R5的啟動子區域發現IRF8的潛在結合位點（圖4A）。染色質免疫沉淀（ChIP）顯示，IRF8免疫沉淀中的PIK3R5啟動子序列顯著富集（圖4B），表明IRF8可直接識別PIK3R5啟動子序列中的結合基序，調控PIK3R5轉錄。

圖 4 A. Jaspar數據庫預測的PIK3R5啟動子區域中可與IRF8結合的潛在基團。B. Molt4細胞中PIK3R5的ChIP‐qPCR分析和相應的電泳圖譜。

隨后，研究人員對T-ALL數據集GSE13159進行基因組富集分析（GSEA），結果顯示T-ALL患病受試者體內各種m6A調控因子發生顯著變化，其中以FTO的變化水平最為明顯（圖5A）。Pearson相關分析表明，在兩個獨立的T-ALL群體中，FTO和IRF8的表達存在明顯的負相關性（圖5B）。

圖 5 A. T-ALL患病受試者和健康供體（HDs）骨髓中m6A調節因子的Log2表達值。B. 來自GSE13159的174份T-ALL樣本中FTO和IRF8表達水平的相關性，Pearson相關性分析。

接下來，用小發夾RNA（shRNA）慢病毒敲除FTO或使用FB23-2抑制FTO水平進行實驗，檢測發現，兩種方式均會導致IRF8表達水平升高（圖6A-B），證明IRF8的表達受到FTO介導的m6A修飾的負調控。

圖 6 A. 通過Western印跡檢測轉染FTO shRNA慢病毒（shFTO-1和shFTO-2）或陰性對照（shNC）的Molt4細胞中FTO和IRF8的水平。B. 轉染shFTO-1、shFTO-2或shNC慢病毒的Molt4細胞中IRF8 mRNA水平的qRT-PCR分析。

隨后，研究人員使用FB23-2處理Molt4細胞，發現m6A的總體豐度提高（圖7A），且IRF8的表達提高2至3倍（圖7B）。MeRIP-seq分析顯示，FTO失活導致IRF8 3′非翻譯區（UTR）的m6A水平明顯增加。此外，FTO RIP-seq分析顯示，FTO結合峰富集在IRF8 mRNA轉錄本中，IRF8轉錄本3′UTR中的軌跡與m6A峰重疊（圖7C）。

圖 7 A. 用2 µm FB23-2或DMSO（NC）培養48小時的Molt4細胞中mRNA的總體m6A豐度，并用LC-MS/MS描述m6A/A的比率。B. DEGs的火山圖；IRF8用黑點標出。藍點：下調基因；紅點：上調基因。C. Integrative Genomics Viewer (IGV)追蹤描繪用DMSO載體或FB23-2處理的Molt4細胞中IRF8基因的m6A修飾，以及IRF8基因座中的FTO RIP-seq信號和相應的輸入信號。

之后設計引物擴增IRF8 3′UTR中包含預測的潛在結合位點的序列（圖8A），并進行RIP-qPCR檢測，共篩選出五個可能被FTO直接結合的潛在m6A位點（圖8B）。隨后，將候選m6A位點從A到T分別替換（MUT1至MUT5，圖8C），并構建野生型和五個突變型IRF8 3′UTR報告載體。經研究發現，轉染WT報告載體細胞的熒光素酶活性明顯高于HEK293T-shNC細胞。并且轉染MUT1至MUT5報告載體后，可以恢復熒光素酶活性（圖8D）。表明IRF8是FTO的一個關鍵靶點，FTO通過這些m6A位點負調控IRF8 mRNA的表達。隨后，研究人員使用FB23-2和Actinomycin D處理Molt4和Jurkat細胞，發現IRF8轉錄本的半衰期明顯延長（圖8E）。表明抑制FTO的去甲基化活性可通過促進RNA穩定性和減少RNA降解來恢復IRF8 mRNA的表達。

圖 8 A. IRF8 3′ UTR中潛在的m6A結合位點（位點1-5）示意圖。引物組3（IP3）包括兩個位點：位點3和位點4。B. FTO RIP-qPCR分析顯示FTO與Molt4細胞中IRF8 mRNA轉錄本結合。C. 克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體的IRF8 mRNA 3′ UTR野生型（WT）以及m6A識別位點從A核苷酸突變為T核苷酸的五個突變序列（MUT1至MUT5）示意圖。D. 野生型IRF8 mRNA 3′ UTR（WT）和突變型IRF8 mRNA 3′ UTR（MUT1至MUT5）報告載體轉染有或無FTO敲除的HEK293T細胞的相對熒光素酶活性。E. 用5 µm FB23-2或DMSO（NC）預處理Molt4和Jurkat細胞24小時，并在指定時間用5 µg/mL Actinomycin D培養的IRF8 mRNA降解檢測，并與0小時的mRNA水平歸一化。

最后研究人員使用FB23-2處理Irf8+/+組和Irf8-/-組的T-ALL小鼠模型（圖9），并通過進行流式細胞術，點印跡檢測以及免疫印跡等分析。結果表明，抑制FTO的m6A去甲基化酶活性，能恢復T-ALL中IRF8的表達，從而通過PI3K/AKT信號轉導抑制T-ALL的發生。

圖 9 建立Irf8-/-和Irf8+/+ T-ALL小鼠模型及FB23-2給藥時間表（FB23-2：2 mg/kg）。

該研究使用了購自AbMole的FB23-2（M9422）和 ActinomycinD（M4881）兩種產品，FB23-2是一種新型FTO小分子抑制劑，可直接與FTO結合，選擇性地抑制m6A去甲基化酶的活性，在外顯子RNA甲基化靶向研究領域具有巨大的潛力和優勢。在該實驗中，研究人員多次使用FB23-2抑制FTO活性，進而更好的研究FTO與IRF8表達之間的調控機制。Actinomycin D是一種轉錄抑制劑，在該實驗中用于在 mRNA降解分析實驗中抑制轉錄，避免新轉錄的mRNA影響實驗結果。

研究人員使用FB23-2抑制FTO的活性，發現IRF8的表達水平升高，細胞增殖受到FB23-2劑量依賴性抑制（圖10A-B），并可以通過敲除IRF8得到有效緩解。進一步研究發現，FB23-2處理和IRF8敲除之間在細胞活力（圖10C）和集落形成活性（圖10D）方面具有明顯的交互作用，說明IRF8的表達受到FTO介導的m6A修飾的負調控。

圖 10 A. 用不同濃度的FB23-2或DMSO（NC）處理Molt4細胞48小時的IRF8 mRNA水平。B. 用不同濃度的FB23-2或DMSO（NC）處理的Molt4細胞的增殖情況。C. 用shIRF8-1、shIRF8-2或shNC慢病毒轉染的Molt4細胞經FB23-2處理后的活力。D. 轉染shIRF8-1、shIRF8-2或shNC慢病毒并經1 µm FB23-2處理的Molt4細胞的集落形成能力。

此外，研究人員通過對Irf8+/+組和Irf8-/-組的T-ALL小鼠進行FB23-2處理（圖9）。流式細胞術顯示，給藥FB23-2能顯著降低Irf8+/+組骨髓、血液和脾臟中GFP+細胞的比例，以及Ki67的水平（圖11A），并且小鼠的存活時間延長（圖11B）。說明FB23-2能有效減輕Irf8+/+T-ALL小鼠的白血病負擔并延長其生存期。免疫印跡和免疫熒光分析表明，FB23-2能顯著增加Irf8+/+組小鼠骨髓和脾臟白血病細胞中IRF8的表達，并抑制PIK3R5的表達和AKT的磷酸化（圖11C-D）。因此，研究人員認為FB23-2抑制FTO的m6A去甲基化酶活性，能成功恢復T-ALL中IRF8的表達，并能通過抑制PI3K/AKT信號轉導，從而抑制白血病的發生過程。

圖 11 A. 流式細胞儀測定的GFP+門控骨髓細胞的Ki67表達水平。B. 用FB23-2或DMSO（NC）處理的Irf8-/-組和Irf8+/+組小鼠的存活率。C. 免疫印跡分析FB23-2或DMSO（NC）處理的Irf8+/+T-ALL小鼠骨髓中的IRF8、PIK3R5和p-AKT水平。D. 給藥FB23-2或DMSO（NC）后Irf8+/+T-ALL小鼠脾臟中IRF8、PIK3R5和p-AKT表達的免疫熒光圖片。

總之，該研究揭示了一種新的T-ALL基因調控機制，并為T-ALL的遺傳機制和靶向研究提供了新的視角。

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