貼壁細胞培養的實驗流程及注意事項

瀏覽次數：1130　發布日期：2024-7-30　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

一、貼壁細胞培養介紹

細胞培養技術在現代生物學、醫學研究以及生物技術領域中具有舉足輕重的地位。其中，貼壁細胞培養作為一種常見的細胞培養方式，對于研究細胞的生理、生化特性以及疾病機制等方面發揮著重要作用。

貼壁細胞是指在體外培養條件下，需要依附于特定的支持物表面才能生長和增殖的細胞類型。這些細胞通常來源于組織或器官，具有特定的形態和功能特征。常見的貼壁細胞包括成纖維細胞、上皮細胞、內皮細胞等。貼壁細胞培養的優點在于能夠更好地模擬細胞在體內的生長環境，有助于維持細胞的正常形態和功能。通過貼壁細胞培養，研究人員可以深入研究細胞的生長、分化、代謝以及對藥物和外界刺激的反應。

二、貼壁細胞培養的實驗流程

（一）準備工作
1. 培養室的清潔與消毒：確保培養室處于無菌狀態，定期對環境進行清潔和消毒。
2. 培養器具的處理：培養瓶、培養皿、移液器等器具需要經過嚴格的清洗、烘干和滅菌處理。
3. 培養基的配制：根據細胞類型選擇合適的培養基，并添加所需的血清、生長因子等成分。

（二）細胞的復蘇
1. 從液氮中取出凍存的細胞管，迅速放入 37℃水浴中，輕輕搖動使其快速解凍。
2. 將解凍后的細胞懸液轉移至離心管中，加入適量的培養基，離心去除凍存液。
3. 將細胞重懸于新鮮培養基中，接種到培養瓶或培養皿中。

（三）細胞的培養
1. 將接種后的細胞放入培養箱中，設置合適的溫度（通常為 37℃）、二氧化碳濃度（一般為 5%）和濕度。
2. 定期觀察細胞的生長狀態，包括細胞形態、密度等。

（四）細胞的傳代
1. 當細胞生長達到一定密度時，需要進行傳代。首先吸出舊的培養基，用 PBS 溶液清洗細胞。
2. 加入適量的消化液（如胰酶和重組胰酶類似物），在顯微鏡下觀察細胞變圓、脫落后，加入含血清的培養基終止消化。
3. 將細胞懸液離心，去除上清液，重懸細胞于新鮮培養基中，按照適當的比例接種到新的培養容器中。

（五）細胞的凍存
1. 選擇處于對數生長期、生長狀態良好的細胞進行凍存。
2. 消化收集細胞，離心后用凍存液重懸細胞，并分裝到凍存管中。
3. 將凍存管放入程序降溫盒中，按照一定的降溫速率降至 -80℃，然后轉移至液氮中長期保存。

三、貼壁細胞培養注意事項

（一）無菌操作
1. 在整個實驗過程中，嚴格遵守無菌操作原則，避免微生物污染。
2. 操作前對手部和實驗器具進行消毒，在超凈工作臺內進行細胞操作。

（二）培養環境
1. 保持培養箱內溫度、二氧化碳濃度和濕度的穩定。
2. 定期檢查培養箱的性能，確保其正常運行。

（三）細胞觀察
1. 每天觀察細胞的生長狀態，包括形態、密度、有無污染等。
2. 及時發現問題并采取相應的措施，如調整培養條件、處理污染等。

（四）培養基和血清
1. 選擇合適的培養基和血清，并注意其保質期和質量。
2. 定期更換培養基，避免營養成分的耗盡和代謝產物的積累。

（五）消化操作
1. 控制消化液的濃度和作用時間，避免過度消化損傷細胞。
2. 消化過程中在顯微鏡下密切觀察細胞狀態，及時終止消化。

（六）細胞傳代
1. 按照適當的比例進行傳代，避免細胞過度稀疏或過度密集。
2. 傳代后的細胞需要一定的時間來適應新的環境，注意觀察其生長情況。

四、細胞消化方案和對比

（一）胰酶消化法
優點：
廣泛適用性：適用于大多數貼壁細胞。
消化效果顯著：能夠快速使細胞從培養表面解離。
缺點：
可能損傷細胞：過度消化或消化時間不當可能對細胞造成損害。
對細胞表面蛋白有影響：可能破壞細胞表面的某些蛋白結構。

（二）膠原酶消化法
優點：
溫和性：對細胞的損傷相對較小，尤其適用于原代細胞。
保持細胞完整性：有助于維持細胞的形態和功能。
缺點：
消化時間長：通常需要較長的時間才能達到理想的消化效果。
成本較高：膠原酶的價格相對較高。

（三）胰酶-EDTA 混合消化法
優點：
增強消化效果：結合了胰酶和 EDTA 的作用，提高解離效率。
縮短消化時間：相比單獨使用胰酶，可能減少消化所需的時間。
缺點：
EDTA 潛在影響：EDTA 可能對細胞內的離子平衡產生一定干擾。

（四）EDTA 消化法
優點：
相對溫和：對細胞的損傷較輕微。
不破壞蛋白：對細胞表面蛋白結構影響較小。
缺點：
消化能力較弱：單獨使用時，可能無法完全解離細胞。

五、重組胰酶類似物的介紹

重組胰酶類似物是通過現代生物技術手段，利用基因工程和重組 DNA 技術生產的一種蛋白酶。它的設計旨在模擬天然胰酶的消化功能，但在性能和特性上進行了優化和改進。

重組胰酶類似物通常是在特定的微生物宿主（如大腸桿菌、酵母等）中進行表達和生產。通過基因工程技術，可以對胰酶的基因進行改造，以獲得具有特定性質的酶蛋白，如更高的活性、更好的穩定性、更低的免疫原性等。

與傳統的天然胰酶相比，重組胰酶類似物在生產過程中能夠更好地控制質量和純度，減少雜質和變異性的影響。這使得其在細胞培養、生物制藥以及生物技術研究等領域具有更廣泛的應用前景。

六、重組胰酶類似物進行細胞消化的優點是什么

（一）高效消化
具有較高的酶活性，能夠快速有效地使貼壁細胞從培養表面解離。縮短消化時間，提高實驗效率。
（二）溫和性
對細胞的損傷相對較小，有助于維持細胞的活力和功能。
減少因消化過程導致的細胞凋亡和死亡。
（三）質量穩定
由于是通過基因工程生產，其質量和活性更穩定，批間差異小。為實驗結果的可重復性提供保障。
（四）純度高
減少雜質的存在，降低對細胞的潛在不良影響。提高細胞培養的成功率和質量。
（五）易于控制
可以根據實驗需求精確調整使用濃度和消化時間。更好地適應不同類型的貼壁細胞和實驗條件。

七、逐典生物 TrypLUS 重組胰酶類似物消化液介紹

逐典生物TrypLUS 消化液是一款即開即用、可常溫放置的無動物源的胰酶替代物。利用微生物重組表達的胰蛋白酶類似酶，對傳統胰蛋白酶在穩定性、純度以及使用便捷度上實現了超越。 TrypLUS 消化液具有高效的消化能力，能夠在較短的時間內使貼壁細胞從培養容器表面解離，同時最大程度地減少對細胞的損傷。