近些年，生物3D打印技術廣泛應用于皮膚組織修復工程，即利用如膠原蛋白、明膠、纖維蛋白、果膠、透明質酸和細胞外基質（extracellular matrix ，ECM）等各種不同的生物墨水，開發和人體皮膚具有類似甚至相同機械特性、組織結構和細胞活性的人造皮膚，將其用于創傷修復、藥物開發和基礎研究等。然而，現有生物墨水所構建的人造皮膚無法滿足實際應用要求。

 

葡萄牙波爾圖大學衛生和創新研究所的科研團隊于2024年在《Biomimetics》雜志發表了文章《Bioinspired and Photo-Clickable Thiol-Ene Bioinks for the Extrusion Bioprinting of Mechanically Tunable 3D Skin Models》。在該文中，作者利用果膠、多肽、甲基丙烯酸、CaCl2、人成纖維細胞作為生物墨水材料，構建了一種新型皮膚細胞模型，并測試機械性能、組織相容性等指標，為開發更理想的人造皮膚提供了新的研究依據。

1. 以果膠作為主要成分構建生物墨水

果膠是一種具有優異組織相容性的天然多糖，添加不同比例的甲基丙烯酸酯后形成甲基丙烯酸果膠（pectin methacrylate，PECMA）。PECMA可以與特定肽序列中的半胱氨酸殘基在光照的情況下發生硫醇-烯反應光交聯；另一方面和CaCl2中的鈣離子結合，實現離子交聯，對墨水流變性能進行調節，達到與天然真皮類似的機械性能。（圖1 a和b）

2. 將制備好的PECMA和人的真皮成纖維細胞混合為待打印的生物墨水，通過西班牙Regemat 3D公司的Bio V1 3D生物打印機，按預先設定程序打印成特定結構，并在紫外光下交聯40秒，形成穩定的共價結合網絡，實現與皮膚類似的機械性能與生物活性。培養7天后，將人角質形成細胞（HaCaT細胞）接種在該皮膚模型上，建立雙層皮膚結構（圖1 c） 。

 

圖 1.生物墨水設計和3D皮膚模型打印流程示意圖。（a） 使用甲基丙烯酸酯對果膠進行化學改性，產生甲基丙烯酸果膠（PECMA），甲基丙烯酸酯用于光交聯，羧基用于與鈣結合

（b） 通過聚合物主鏈中的甲基丙烯酸酯和肽序列中的半胱氨酸（突出顯示為綠色）之間的硫醇-烯反應，實現水凝膠生物功能化（c） 第一步，由PECMA聚合物和定制的肽序列制備一種光交聯生物墨水，并通過添加氯化鈣進行離子交聯來調節其流變性，然后混合和均質化以獲得物理交聯的生物墨水；第二步，在生物墨水中加入真皮成纖維細胞并用Regemat 3D生物打印機打印成預設的真皮模型，并進行體外培養7天；第三步，將HaCaT細胞接種到真皮模型上，體外培養7天；第四步，體外培養7天，待后續檢測

1. 用紫外光照射40秒（光交聯）后，添加了肽交聯劑的墨水具有814.0±129.1Pa的彈性模量；而未添加肽交聯劑的墨水沒有建立足夠密度的共價鍵，導致培養基中水凝膠結構的完整性迅速喪失。然而，如果將光照時間延長到60秒，即使沒有肽交聯劑，也可以形成穩定的水凝膠結構。該結果說明，在肽交聯劑存在的情況下，二級水凝膠交聯主要通過階梯生長機制進行，反應速率和形成水凝膠結構的效率更快。

2. 在不同硬度的水凝膠中，成纖維細胞的生長狀態有顯著差異。在低硬度水凝膠中，細胞擴散和細胞間接觸的能力明顯高于中等硬度和高硬度的水凝膠。說明水凝膠的硬度，影響成纖維細胞在模擬真皮模型中生長以及形成類似真皮結構的過程。

3. 將HaCaT細胞接種在真皮模型并培養28天后，評估關鍵標記物的位點特異性表達，免疫組化結果顯示：該皮膚模型呈現出預想的雙層結構，上層為表皮（角質形成細胞），下層為真皮（真皮成纖維細胞）。這種結構與天然皮膚類似，未來可以考慮用于替代天然皮膚（圖2）。

圖2 生物打印 3D 皮膚模型（a） 具有圓形和方形形狀的雙層皮膚模型圖示，以及培養28天后它們的結構完整性（比例尺頂部：2.5毫米;比例尺下：5毫米）。（b） 皮膚模型的免疫染色圖示（Epidermis表皮層：細胞角蛋白（綠色）和細胞核（藍色）;真皮層Dermis：波形蛋白（紅色）和細胞核（藍色）;比例尺：100μm））。

利用果膠、肽交聯劑、甲基丙烯酸酯和成纖維細胞，可以構建出理想的真皮模型，其理化性能和細胞性能可以通過調節水凝膠的硬度、紫外光照時間等方式實現；在接種HaCaT細胞后，更可以構建出理想的雙層皮膚細胞結構。這為未來人造皮膚的開發提供了新的依據。

更多資訊請查閱原文：https://doi.org/10.3390/biomimetics9040228

 

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