細胞核分離試劑盒的應用：探索人脊髓膠質細胞異質性
影響因子：5.07
伯豪生物產品：伯優®細胞核分離試劑盒
研究背景
盡管有大量證據表明脊髓的神經膠質細胞在感覺感知和處理以及運動行為中起著關鍵作用，但其細胞、功能和空間分布的異質性在很大程度上仍不清楚。來自單細胞和單細胞核RNA測序（scRNA-seq和snRNA-seq）研究的新興數據揭示了中樞神經系統（CNS）特定神經膠質細胞類型之間的細胞和分子異質性。Zheng等人過scRNA-seq比較了大腦皮層和脊髓的小膠質細胞亞型，在大腦皮層中發現了三個亞群，在脊髓中發現了兩個亞群，并顯示了脊髓和皮層小膠質細胞之間的不同亞群。Floriddia等人也使用scRNA-seq將小鼠CNS中的成熟少突膠質細胞分為六個不同的亞群，這些亞群對脊髓損傷表現出不同的反應。雖然對小鼠CNS中神經膠質細胞的細胞和功能異質性已有相對較好的了解，但技術障礙和高質量組織樣本獲取受限限制了人類脊髓研究方面的此類進展。
研究目的
通過空間轉錄組學和snRNA-seq來繪制人類脊髓中神經膠質細胞的異質性。并通過比較人類和小鼠的轉錄組譜來探討種間異質性。通過本研究的探索和驗證人類脊髓神經膠質細胞的功能和空間分布，有望成為未來研究神經膠質細胞相關人類生理和病理條件分子基礎的重要資源。
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研究結果
1. 神經膠質細胞亞型的鑒定
為了實現單細胞分辨率，本研究對來自9名成人腰椎膨大區域的脊髓中分離出的64,021個細胞核進行了單細胞核RNA測序（snRNA-seq）。根據這些數據，我們確定了八種主要細胞類型，它們具有獨特的分子標記物。星形膠質細胞（占總細胞核的5.2%）通過表達代表性標記物AQP4、ATP1A2和SLC1A2進行鑒定；小膠質細胞（占總細胞核的13.1%）通過PTPRC、CTSS和ITGAM進行鑒定；少突膠質細胞（占總細胞核的58.8%）則通過MBP、MOBP、MOG和PLP1進行鑒定。
后續又通過空間轉錄組數據探索了這三種神經膠質細胞類型的空間位置。數據表明，星形膠質細胞在脊髓中廣泛存在，但在白質中的表達高于灰質。這一發現通過免疫熒光染色得到了驗證。小膠質細胞和少突膠質細胞則主要分布在白質中。
為了確定人類脊髓中每種神經膠質細胞類型內的異質性，根據它們的轉錄特征，將星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞各自分類為六個亞群。在小鼠脊髓中，基于先前的研究結果，星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞分別被分類為五個、四個和五個亞群。通過進一步分析每個亞群中獨特高表達的代表性標記基因，最終鑒定出與軀體感覺系統障礙相關的幾種標記基因。這些包括：人類星形膠質細胞亞群1（C1）中的CACNB2（鈣電壓門控通道輔助亞基β2）；人類星形膠質細胞亞群3（C3）和小鼠少突膠質細胞亞群5（C5）中的SCN7A（鈉電壓門控通道α亞基7）；人類小膠質細胞亞群1（C1）中的GRID2（谷氨酸離子型受體δ型亞基2）；小鼠小膠質細胞亞群2（C2）中的Ctss（組織蛋白酶S）；以及小鼠少突膠質細胞亞群1（C1）中的Grm3（代謝型谷氨酸受體3）。
2. 神經膠質亞型的細胞間通訊分析和RNA速度分析
為了探究不同亞型星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞之間的相互作用，研究又分析了相互作用的強度和數量。發現所有亞型的神經膠質細胞均存在關聯，其中星形膠質細胞C1和C5之間聯系尤為緊密。接下來，我們比較了每種細胞類型的傳出和傳入相互作用強度。不同亞型的脊髓神經膠質細胞參與的信號通路在活躍程度上存在顯著差異。一些神經膠質細胞亞型表現出重疊的信號通路，如小膠質細胞C1和少突膠質細胞C1及C2。
3. 神經膠質細胞亞型的空間可視化
接下來，研究利用空間轉錄組數據探索了神經膠質亞型的空間位置。從最具代表性的腰椎膨大節段中選擇空間轉錄組數據，并用每個樣本的相應節段進行分析，最終確定了五種主要的細胞亞型。利用SpaCET軟件，將每個樣本的snRNA-seq數據與相應的空間切片相結合，以表征神經膠質亞型的分布模式。為了更詳細地分析不同神經膠質亞型的空間分布，研究將人類脊髓灰質分為三個區域：淺背角（板層I-II）、深背角（板層III-VI）和腹角（板層VII-IX）（Todd, 2010）。小膠質細胞C2和C5，以及少突膠質細胞C3和C5，主要分布在淺背角；星形膠質細胞C2、C5和C6，小膠質細胞C3和C6，以及少突膠質細胞C1、C2和C4，則出現在深背角；而小膠質細胞C1和少突膠質細胞C6則位于腹角。
4. 人與鼠的神經膠質細胞亞型異質性
在UMAP分析中，人類脊髓的整體膠質細胞數據與小鼠的數據重疊良好。然而，按細胞類型細分數據后，發現小鼠和人類在所有類型的膠質細胞（包括星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞）中都存在顯著的異質性。為了更深入地了解人類和小鼠之間經典脊髓標志物的保守性和差異性，后續分析了這些標志物在兩種物種中的表達譜。這些標志物包括眾所周知的離子通道、神經遞質受體、神經肽和轉錄因子。
首先，研究分析了膠質細胞亞群之間多個基因表達的差異。在星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞中，多個基因的表達水平在亞群之間顯示出顯著的異質性。這些基因包括NALCN、Kcnj10、GRM3、Gria2、SOX5、CACNA1D、RORA和KCND2。
接下來，研究還比較了人類和小鼠膠質細胞中這些標志物基因的轉錄組數據。總體而言，轉錄模式在人類和小鼠之間存在顯著差異。在人類脊髓的星形膠質細胞中，CACNA1C的表達顯著高于CACNA1E和CACNA1A；而在小鼠脊髓的星形膠質細胞中，這些基因的表達沒有顯著差異。在人類脊髓星形膠質細胞中，GRINA的表達高于GRIN3A，而在小鼠脊髓星形膠質細胞中則相反。在人類脊髓星形膠質細胞中，SOX5的表達高于RORB和ESRRG，而在小鼠脊髓星形膠質細胞中，它們的表達水平相當。在人類脊髓小膠質細胞中，KCND2和KCND3的表達水平相當，而在小鼠脊髓小膠質細胞中，Kcnd2的表達水平高于Kcnd3。在人類脊髓小膠質細胞中，OPRM1的表達高于HTR4；而在小鼠脊髓小膠質細胞中，兩者表達無顯著差異。在人類脊髓小膠質細胞中，ZFHX3的表達高于RORA，而在小鼠脊髓小膠質細胞中則相反。在小鼠脊髓少突膠質細胞中，Kcnq3的表達高于Kcnq1；而在人類脊髓少突膠質細胞中，它們的表達相似。
5. 神經膠質細胞中與疾病相關的基因
首先，本研究探索了兩種慢性疼痛（神經病理性和炎癥性）相關的基因表達模式。在星形膠質細胞中，常見的神經病理性/炎癥性疼痛基因RNF19A/Rnf19a在人類中高表達，但在小鼠中不表達，而GRM5/Grm5在小鼠中高表達，但在人類中僅略有表達。與神經病理性疼痛相關的基因HMGB1/Hmgb1和DPYSL2/Dpysl2在人類星形膠質細胞中高表達，但在小鼠中僅略有表達。DNMT3A/Dnmt3a在小鼠星形膠質細胞中高表達，但在人類中僅略有表達。然而，與炎癥性疼痛相關的基因PRKCA/Prkca在人類和小鼠星形膠質細胞中均表現出高表達水平。
在小膠質細胞中，GRM5/Grm5在小鼠中高表達，但在人類中僅略有表達。與神經病理性疼痛相關的基因HMGB1/Hmgb1、MAPK14/Mapk14、PIK3CB/Pik3cb和CRK/Crk在人類中高表達，但在小鼠中僅略有表達。與炎癥性疼痛相關的基因P2RX4/P2rx4在人類中高表達，但在小鼠中僅略有表達。在少突膠質細胞中，GRM5/Grm5在小鼠中高表達，但在人類中僅略有表達。GRAP2/Grap2在人類C5中高表達，但在小鼠中僅略有表達。與小膠質細胞和星形膠質細胞一樣，PRKCA/Prkca在人類和小鼠少突膠質細胞中均表現出高表達。
6. 神經膠質細胞簇的功能分配
為了探索每種膠質細胞中富集基因的功能特性，進行了GO術語分析，結果揭示了人類和小鼠之間幾個共同的生物過程。人類和小鼠星形膠質細胞中的富集基因主要與神經系統發育有關，包括細胞-細胞粘附、細胞外基質組織、樹突形態發生、神經元投射發育的調節、神經系統發育和細胞遷移。在人類和小鼠的小膠質細胞中，富集基因主要與免疫反應有關，包括抗原加工和呈遞、免疫反應、炎癥反應、先天免疫反應、T細胞增殖以及參與炎癥反應的白三烯產生。在人類和小鼠的少突膠質細胞中，富集基因主要與髓鞘形成有關，包括髓鞘形成、軸突導向、軸突包繞、髓鞘形成的調節和軸突發生。
7. 人類脊髓膠質細胞基因表達的性別差異
通過對男性和女性人類不同脊髓膠質亞群中的基因表達模式進行比較，發現當FC（倍數變化）≥1.33且調整后的P值<0.05時，將基因分類為差異表達。值得注意的是，星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞中基因表達的最大差異與參與X染色體失活的性別特異性基因（如XIST）和Y染色體基因（包括UTY、USP9Y、TTTY14和NLGN4Y）有關，這為我們結果的可靠性提供了有力支持。
在人類脊髓的所有星形膠質細胞群中，與女性相比，男性NEAT1和CHI3L1的表達水平較高，而CST3的表達水平較低。值得注意的是，與女性相比，男性在星形膠質細胞C5中的NEAT1和在C2及C5中的CHI3L1表達水平也較低。在星形膠質細胞C1中，與女性相比，男性MT3的表達水平較高，而NEAT1、EGLN3和CHI3L1的表達水平較低。在星形膠質細胞C4中，與女性相比，男性SLC14A1、TRPM3和CACNB2的表達水平較高，而SLC38A1、Dpysl3和NEAT1的表達水平較低。
在人類脊髓的所有小膠質細胞群中，所有差異表達基因（DEGs）均位于X染色體和Y染色體上。在小膠質細胞C1中，與女性相比，男性ROR2的表達水平較低。在小膠質細胞C6中，與女性相比，男性MT-ATP6的表達水平較高，而CHI3L1的表達水平較低。
在人類脊髓的所有少突膠質細胞群中，與男性相比，女性MT-ND4、MT2A、MT-ATP6、MT-CO3、MT-ND2、MT-ND3和MT-CO2的表達水平較高。在少突膠質細胞C4中，與男性相比，女性PLP1和HMGB1的表達水平較高，而SIAH1的表達水平較低。在少突膠質細胞C6中，女性MOBP的表達水平高于男性。
研究總結
本研究利用（snRNA-seq）和空間轉錄組學技術，繪制了人類脊髓中星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞的細胞及分子異質性圖譜。結果顯示，星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞各自被分為6個不同的轉錄組亞群，揭示了人類和小鼠脊髓神經膠質細胞類型中存在顯著的物種間異質性。此外，研究還檢測到人類脊髓神經膠質細胞中的性別特異性基因表達差異。這些發現為脊髓相關疾病的研究提供了重要資源。
參考文獻：
https://doi.org/10.7554/eLife.92046
