自身免疫性肝炎（AIH）是一種免疫介導的慢性肝病，由免疫系統攻擊肝細胞引起，其特點是血清轉氨酶水平升高、IgG水平升高和界面性肝炎。之前的研究發現，基于利妥昔單抗（CD20抗體）的B細胞清除療法是一種有效策略，適用于對標準療法無應答的患者。

這種疾病由T細胞介導，其中抗原激活的CD4+和CD8+ T細胞作為效應細胞分化和增殖。B細胞也被認為參與了自身免疫，具體途徑是抗原呈遞、產生自身抗體和細胞因子。然而，確切的分子機制至今仍未闡明，這可能是因為缺乏合適的AIH模型。

日本慶應義塾大學醫學院的研究人員近日利用腺相關病毒（AAV）IL-12模型，再現了自身反應性B細胞相關的AIH病理學的重要特征。他們成功鑒定了脾臟B細胞與細胞毒性CD8+ T細胞之間的相互作用。這項研究成果發表在《JHEP Reports》雜志上。
 

圖片來源：《JHEP Reports》
（https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2023.100757）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員在賽業生物的協助下構建了實驗性AIH模型，通過AAV載體在肝臟中過表達IL-12觸發細胞毒性T細胞的擴增，重現AIH患者的臨床特征。他們利用CD20抗體和B細胞過繼轉移驗證了脾臟B細胞的致病作用，并通過RNA測序分析發現了IL-15的表達上調。他們還通過流式細胞術等分析確認了脾臟B細胞與細胞毒性T細胞之間的相互作用。

技術路線
01 構建實驗性AIH模型，利用CD20抗體和過繼轉移分析脾臟B細胞的作用
02 通過RNA測序分析發現B細胞中的IL-15表達上調，并驗證肝炎發展是否依賴于IL-15
03 分析脾臟B細胞與CD8+ T細胞之間的相互作用及背后的分子機制
04 利用AIH患者的樣本驗證以上結果，以探索其轉化潛力

研究結果
1 實驗性AIH模型的構建
研究人員構建了pAAV IL-12質粒載體，并進行了AAV病毒包裝，然后他們將AAV IL-12注射到小鼠體內，并觀察給藥1-8周后的病理變化，以確定實驗性AIH（eAIH）模型的適當終點（其中AAV病毒包裝服務由賽業生物提供）。他們在4周內觀察到血清谷丙轉氨酶（ALT）、IgG、抗核抗體水平升高以及界面性肝炎增加，且ALT和AST（谷草轉氨酶）在4周時達到峰值。因此，他們在第4周開展了病理學分析，發現小鼠肝臟和脾臟中CD4+ T細胞和CD8+ T細胞的數量增加，其他特征也與AIH患者一致。這些結果表明，AAV IL-12模型適用于探索AIH病理學中的相關機制。

2 B細胞通過擴增CD8+ T細胞加重了eAIH
以往的研究顯示，利用CD20抗體清除B細胞對難治性AIH患者有效果。于是，研究人員也在AAV IL-12模型中研究了CD20抗體對肝炎的療效。CD20抗體治療導致肝臟和脾臟中的B細胞減少，肝炎在部分程度上改善。值得注意的是，他們觀察到血清IgG水平下降。CD20抗體治療降低了記憶性T細胞的數量，但不影響肝髓系細胞的數量。這些結果表明，B細胞在肝炎的發展過程中起著致病作用。

由于脾臟中的B細胞豐度很高，研究人員推測該器官中的B細胞尤其具有致病作用。為了弄清這一點，他們從注射了AAV IL-12的小鼠脾臟中分離出B細胞，將其過繼轉移至脾切除小鼠體內（圖1）。雖然脾切除術降低了ALT水平，但致病性B細胞的過繼轉移會逆轉這種改善。肝組織學和肝顆粒酶B+CD8+ T細胞的數量表現出類似的趨勢，而肝CD4+ T細胞的數量沒有變化。由此可見，脾臟B細胞通過擴增CD8+ T細胞（CTL）在肝炎的發展過程中發揮作用。
 

圖1 致病性B細胞的過繼轉移加重了脾切除小鼠的肝炎[1]

3 致病性B細胞中的IL-15表達增加
之后，通過RNA測序分析，研究人員發現致病性B細胞中IL-15的表達顯著上調。IL-15是一種眾所周知的細胞因子，促進記憶性CD8+ T細胞和CTL的維持和增殖。因此，他們推測B細胞來源的IL-15在誘導CTL及eAIH的后續發展中起關鍵作用。在小鼠脾臟中，B細胞大約占表達IL-15的免疫細胞的55%。在eAIH小鼠的肝臟/脾臟CD4+和CD8+ T細胞中，IL-15受體的表達升高，表明對IL-15信號傳導更加敏感。此外，他們還觀察到，eAIH小鼠脾臟中的B220+ B細胞和CD8+ T細胞彼此相鄰，這表明它們之間存在直接的相互作用。

為了驗證CTL增殖和肝炎發展是否依賴于IL-15，他們通過體內實驗研究了IL-15中和的效果。與預期一致，在注射IL-15抗體后，小鼠的血清ALT水平顯著降低，脾細胞數量減少，而肝臟單核細胞（LMNC）不受影響，表明IL-15抗體對脾臟的作用更強。同樣地，脾臟和肝臟中的總CD8+ T細胞和顆粒酶B+ CD8+ T細胞數量也減少，表明IL-15中和可抑制脾臟和肝臟CTL，從而改善肝炎。

4 IL-15+ B細胞與CD40L+CD8+ T細胞相互作用
為了驗證B細胞與CD8+ T細胞之間的相互作用，研究人員將來自eAIH小鼠的脾臟CD8+ T細胞與分離自eAIH或對照小鼠的脾臟B細胞進行共培養。他們發現，與致病性B細胞的共培養可誘導CD44+CD8+ T細胞的增殖，而對照B細胞則不能（圖2）。值得注意的是，IL-15的中和抑制了CD44+CD8+ T細胞的增殖。這些結果表明，來源于脾臟B細胞的IL-15促進了記憶性CD8+ T細胞的增殖和維持。

那么，B細胞中的IL-15是如何上調的？后續的分析發現，IFN-γ和CD40抗體的聯合刺激可上調小鼠脾臟B細胞中Il15、Cxcl10和Csf1的基因表達，這表明CD40L+細胞在誘導IL-15+ B細胞的過程中發揮重要作用（圖2）。流式分析表明，eAIH中的脾臟CD8+ T細胞表現出CD40L表達上調。這些結果共同表明，脾臟IL-15+ B細胞和CD40L+ CD8+ T細胞相互作用以獲得病理功能。
 

圖2 IL-15+ B細胞與CD40L+CD8+ T細胞相互作用[1]

研究人員假設，記憶性CD8+ T細胞和CTL在脾臟B細胞誘導下增殖，隨后遷移到肝臟造成肝細胞損傷。他們發現，在發炎肝臟的CD8+ T細胞中，趨化因子受體CXCR3的表達明顯增加。CXCR3配體在肝臟中的基因表達也增加，其中Cxcl9的上調最為顯著。CXCL9的中和可改善eAIH。CXCL9抗體治療明顯降低了肝臟顆粒酶B+ CD8+ T細胞和IL-15Ra+ CXCR3+ CD8+ T細胞的數量，表明CXCL9/CXCR3軸在肝炎發展中起著關鍵作用。

5 AIH患者血液中的IL-15+ B細胞增加
最后，為了探索這些結果的轉化潛力，研究人員還分析了患者的臨床樣本。他們發現，AIH患者血清中存在高濃度的IL-15和IL-15+ B細胞，并與ALT水平呈正相關。此外，他們還觀察到CD40L+IL-15Ra+記憶性T細胞的誘導，表明在AIH患者中存在與IL-15+ B細胞的相互作用。這些結果支持在AIH患者中進行轉化研究和靶向治療。

研究結論

圖3 脾臟IL-15+ B細胞在AIH發展中發揮致病作用[1]

這項研究利用實驗性AIH模型再現了人類AIH的臨床特征。通過這個模型，他們發現IL-15和CD40L對脾臟中B細胞與CD8+ T細胞之間的相互作用是不可缺少的，這種互作導致CD8+ T細胞局部擴增，并通過CXCL9/CXCR3軸遷移到肝臟，導致AIH發生。體外和體內分析證實了B細胞在AIH中的致病作用（圖3）。研究人員認為，對致病性B細胞的進一步研究有望催生CD20抗體治療之外的新型治療方法。

參考文獻：
[1]Fujimori S, Chu PS, Teratani T, et al. IL-15-producing splenic B cells play pathogenic roles in the development of autoimmune hepatitis. JHEP Rep. 2023 Apr 7;5(7):100757. https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2023.100757