巨噬細胞——免疫系統的重要成員！  巨噬細胞在各種疾病中充當了怎樣的角色？我們又怎么在實驗室中誘導巨噬細胞并將其進一步分化為不同的亞型呢？讓我們一起來學習一下吧~

01
巨噬細胞：功能和作用機制

巨噬細胞，一種白細胞，其生命旅程開始于骨髓，在分化形成巨噬細胞后被釋放到血液中，隨著血液循環進入各個組織中，并分化成不同的類型，例如大腦中的小膠質細胞和肝臟的 Kupffer 細胞。

巨噬細胞的主要功能是吞噬細菌、病毒等病原體，也可以消滅生物體內的腫瘤細胞和死亡細胞，在生物體中發揮“清道夫”的作用。巨噬細胞還可以通過呈遞抗原，分泌趨化因子和細胞因子的方式參與免疫反應，激活其他免疫細胞。此外，巨噬細胞參與組織修復，在移植器官的存活和排異中發揮作用[1]。

但巨噬細胞也可能成為疾病的幫兇，促進腫瘤生長和轉移，維持病原體在體內的存在，或導致組織損傷和炎癥反應。

圖1. 巨噬細胞吞噬細菌的過程。

圖 2. M1 型和 M2 型巨噬細胞^[2]。

巨噬細胞可以大致分為 M1 和 M2 兩種亞型，M2 可以進一步分為 M2a，M2b，M2c 和 M2d 四種表型。M1 對抗病原體感染，誘導促炎反應。M2 促進抗炎反應和腫瘤發展。另外，M2a 主要介導組織修復；M2b 負責免疫調節；M2c 在吞噬作用中起作用，M2d 參與腫瘤的血管生成。

02
巨噬細胞：如何誘導分化？

在實驗室中通常從外周血單核細胞 (PBMCs) 或人急性單核白血病細胞 THP-1 開始，通過加入特定的分化因子，誘導它們分化為成熟的巨噬細胞。

一、從外周血液誘導巨噬細胞分化

外周血單核細胞可以從血樣中通過密度梯度離心法獲得。

• 將新鮮的抗凝血液樣品與平衡密度梯度介質(Ficoll-Hypaque-1077 或 Lymphoprep) 混合。

• 通過低速離心 (400 ×g，30 min) 使不同密度的細胞組分在離心管中形成分層。PBMCs 處于血漿和紅細胞之間的不透明中間層。
• 吸取中層細胞懸液并重復洗滌 (PBS，4°C，250 ×g，10 min) 直至獲得澄清的上清液[3]。
  
  圖 3. 從血樣中分離外周血單核細胞 (PBMCs)^[4]。

圖 4. 從外周血液誘導巨噬細胞分化^[3]。

 
具體步驟 (供參考)^[3]：

(1) 將分離得到的 PBMCs 加入含有 15% FCS 的 10 mL RPMI 1640 (含有 penicillin，streptomycin 和 2 mM glutamine)。計數并將細胞濃度調節至 1×107 cells/mL。
(2) 將 10 mL 細胞懸浮液加入培養皿中。不要去除不貼壁的細胞。
(3) 在 37°C 下用 5% CO₂ 的加濕培養箱孵育細胞。在 2 天和 4 天后更換新鮮的 RPMI/15% FCS 培養基。
(4) 細胞在第 6 天時已經分化為巨噬細胞，并且牢固地貼壁生長。
(5) 取出培養皿并加入 10 mL 冷 PBS，并且置于冰上 30 min。使用細胞刮刀，輕輕地將細胞從板上刮下。
(6) 將細胞以 250 ×g 離心 5 min，并重懸于 RPMI/5% FCS 中并鋪板。
(7) 用新鮮的添加有 10% FCS 的 RMPI 1640 更換培養基。
(8) 加入 10 ng/mL LPS 和 5 U/mL 人重組 IFN-γ (可誘導 M1 極化) 或加入 20 ng/mL 人重組 IL-4 (可誘導 M2 極化)，在 37°C，5% CO₂ 下孵育 24 h。
(9) 去除上清液并更換培養基 (新鮮的添加有 5% FCS 的RMPI 1640)。
 
注意事項^[3]:

• 選取不超過 8 小時的血樣，實驗效果最佳。

• 單核細胞將在大約 1 小時內附著在板上。在這段時間之后，他們將自發地分離。如果要在小板 (例如 6 孔板或 24 孔板) 中分化細胞，則在用溫 PBS 洗滌細胞后，加入 10 mL RPMI1640/FCS 10%，并在 37°C 和 5% CO₂下孵育過夜。在這段時間之后，單核細胞漂浮在上清液中。用細胞刮刀分離貼壁生長的細胞，以 250 ×g 在 4°C 下離心 5 min，對細胞進行計數，鋪板。

• 人血清可以從不同的公司獲得。如果您從獻血者處獲得血清，請制作一個不同供體的池，以避免分化細胞之間的差異。使用前，在 56°C 的水浴中加熱 30 min。

• 僅向一個方向移動細胞刮刀。在幾個方向上移動可能會降低細胞活力。

 
二、用 THP-1 細胞誘導巨噬細胞分化

除了從人血樣中分離單核細胞進而分化得到巨噬細胞外，也可以直接誘導 THP-1 細胞分化，步驟如下^[5][6]。

▐  細胞培養

▐  誘導巨噬細胞分化 

(1) 將 THP-1 細胞接種在孔板中 (密度為 5 × 10⁵cells/mL)，加入 PMA (濃度為 50-200 ng/mL)，處理細胞 24 h 以誘導分化。

圖 5. PMA (HY-18739) (100, 200 ng/mL) 誘導 THP-1 細胞貼壁和分化。 

 
PMA 處理 24 h 后細胞由懸浮生長變為貼壁生長，高倍鏡下可看到部分細胞的胞漿里含有大量顆粒狀物質，同于之前的透亮狀態; 可觀察到細胞變得更扁平，呈不規則形，部分細胞有偽足伸出，貼壁呈阿米巴樣生長。(已經過 MCE 生物實驗驗證)。

(1) M0 靜息巨噬細胞的極化

在用 PMA 處理細胞 24 h 后，用無血清培養基洗滌分化的貼壁細胞兩次，然后在無 PMA 的培養基中靜置 24 h，以獲得 M0 靜息巨噬細胞。

(2) M1 經典激活巨噬細胞的極化

在用 PMA 處理細胞 24 h 后，用 100 ng/mL LPS 和 20 ng/mL IFN-γ 共培養細胞 24 h，以獲得經典激活的 M1 型巨噬細胞。

(3) M2 替代激活巨噬細胞的極化

在用 PMA 處理細胞 24 h 后，用 20 ng/mL IL-4 和 20 ng/mL IL-13 共培養細胞 24 h，以獲得替代激活的 M2 型巨噬細胞。

03
M1/M2 型巨噬細胞的鑒定

一、形態學差異 

• M1 型巨噬細胞：較為扁平，細胞分布分散，伴有較多的假偽足。這些特點有助于它們識別和吞噬病原體。此外，M1 型巨噬細胞的細胞質內含有大量溶酶體和消化酶，以便分解入侵的病原體^[6]。

• M2 型巨噬細胞：多為圓形體，細胞表面的突起較少。M2 型巨噬細胞的細胞質內含有更多的吞噬體和細胞器，這些結構參與清除死亡細胞和促進組織再生^[6]。

圖 6. M1 型和 M2 型巨噬細胞的形態學特征^[6]。

A. 巨噬細胞在 LPS/IFN-γ 以及 IL4/IL13 的作用下極化為 M1 和 M2 亞型，以及其在光學顯微鏡下的形態特征。B. 左圖：M0/M1/M2 型巨噬細胞在細胞厚度和堅固度方面的形態描述。右圖：M0/M1/M2 型巨噬細胞在電子顯微鏡下的細胞核 (藍) 和肌動蛋白 (綠) 特征。
 
二、表面標志物

• M1 分泌產生促炎性細胞因子，如 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-12，以及高水平的活性氧 (ROS) 和氮物質。

• M2 分泌抗炎性細胞因子，如 IL-10、CCL18 和 CCL22。M2 型巨噬細胞還表達幾種受體，如甘露糖受體 CD206 (或 MRC1)、清除受體 CD163、dectin-1 和 DC-SIGN^[3][7]。

表 1. M1 和 M2 型巨噬細胞分泌的表面標志物^[3][7]。

04
小結

通過本文的介紹，我們不僅學習了巨噬細胞在不同疾病下的功能變化，而且深入探討了其從單核細胞到成熟分化細胞的“升級之路”。巨噬細胞的分化和極化在疾病治療中具有重要的意義，隨著研究的進一步深入，我們也將揭開巨噬細胞的神秘面紗，為多種疾病=治療開發出新的靶點。