多種小鼠模型在建立體內細胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術中的應用
本文轉載于：中國科學院分子細胞卓越中心
2024年10月4日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心周斌研究員在Cell學術期刊在線發表題為Identifying specific functional roles for senescence across cell types的論文。
南模生物為該研究提供了多種小鼠模型：
p16-tdT, p16-CreER, p16-LSL-Dre, Cd68-Cre, R26-RL-tdT-DTR, p16-CreXER, H11-Kdr-mCherry。
該研究基于雙同源重組酶系統建立了體內細胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術，系統探討了肝臟損傷和修復過程中不同細胞類型衰老細胞的命運軌跡及其特定作用。這一研究工作不僅為肝臟疾病的臨床治療提供新的研究方向和理論依據，也為衰老領域和再生醫學研究提供了新的技術路徑與方法。
目前對衰老細胞功能的研究普遍缺乏針對性，通常不加區分地針對所有類型的衰老細胞，忽略了細胞類型的特異性。這使得我們對特定細胞類型衰老細胞的命運軌跡和他們對生理病理的作用知之甚少。為解決這一科學問題，周斌組建立了體內細胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術，揭示了體內細胞衰老的命運軌跡和特定功能。
研究團隊首先構建了一種熒光報告基因小鼠品系p16-tdT，通過檢測不同年齡段各器官中tdT的表達，發現tdT+細胞在不同器官中的類型具有多樣性且比例隨著年齡的增長顯著增加。同時，這些tdT+細胞表現出明顯的SA-β-Gal活性、更低的增殖能力及高表達SASP因子等，進一步驗證了p16Ink4a+細胞的細胞衰老表型。
圖1. 衰老的p16-tdT小鼠多種細胞類型表達tdT
細胞衰老與肝纖維化有相關性，針對肝纖維化這一特定病理過程，研究團隊利用四氯化碳（CCl4）誘導的肝臟損傷模型，結合免疫染色和scRNA測序技術，發現肝損傷中p16Ink4a+細胞主要為內皮細胞和巨噬細胞。對其進行基因表達譜分析，結果表明這些p16Ink4a+巨噬細胞和內皮細胞表現出獨特的基因表達變化，包括SASP因子的表達和細胞衰老相關信號通路上調等。
為進一步研究細胞類型特異性p16Ink4a+細胞在肝損傷和修復中的命運，研究團隊開發了一種名為Sn-pTracer（senescent cells-pulse-chase-tracer）的遺傳系統。該系統利用雙重組酶技術，只在共表達Dre和Cre重組酶的細胞中，R26-RL-tdT（Rosa26-rox-Stop-rox-loxP-Stop-loxP-tdT）報告小鼠的兩個Stop序列才會被移除，從而誘導tdT的表達。
圖2. Sn-pTracer的標記策略圖
研究團隊將巨噬細胞特異性F4/80-Dre或內皮細胞特異性Cdh5-DreER小鼠品系與p16-CreER和R26-RL-tdT小鼠交配，得到了F4/80-Dre; p16-CreER; R26-RL-tdT小鼠（SnMø-pTracer）及Cdh5-DreER; p16-CreER; R26-RL-tdT小鼠（SnEC-pTracer）。在CCl4誘導的肝損傷中，SnMø-pTracer和SnEC-pTracer系統分別精確標記了p16Ink4a+巨噬細胞和p16Ink4a+內皮細胞。
結果發現，肝損傷的p16Ink4a+巨噬細胞顯著增多但修復后大量凋亡，被p16Ink4a-巨噬細胞替代。
圖3. SnMø-pTracer小鼠結果圖
相反，p16Ink4a+內皮細胞在損傷后雖也增加，但在肝臟修復階段大部分存活，表明對內皮細胞而言，其衰老狀態可能是可逆的細胞周期停滯。
圖4. SnEC-pTracer小鼠結果圖
這些發現揭示了不同類型細胞在應對肝損傷時不同的衰老與修復機制，為深入理解細胞命運調控及組織修復策略提供了新視角。
使用Sn-pTracer系統需要具有細胞類型特異性的Dre工具小鼠，相對Cre工具鼠的數量較少。此外，tamoxifen（Tam）在體內的血清半衰期較短，在損傷期間對Sn-pTracer小鼠持續使用Tam誘導以記錄細胞衰老不僅是一種負擔，而且可能對小鼠健康有害。
為克服這些限制，研究團隊開發了一種新的遺傳系統，命名為Sn-cTracer（senescent cells-Cre-induced-tracer）。Sn-cTracer 涉及三種小鼠品系：細胞類型特異性Cre（ER）工具小鼠、p16-LSL-Dre（p16-loxP-Stop-loxP-Dre）和R26-RL-tdT-DTR（Rosa26-rox-Stop-roxP-Stop-loxP-tdT-DTR）。Cre-loxP重組可切除p16-LSL-Dre的Stop序列，從而在Cre表達細胞中將p16-LSL-Dre轉化為p16-Dre，并且只有同時表達Dre和Cre的細胞才能移除R26-RL-tdT-DTR等位基因中的兩個Stop序列，從而永久表達tdT和DTR（白喉毒素受體），實現以細胞類型特異性的方式對p16Ink4a+細胞進行不間斷記錄和遺傳清除。
圖5. SnEC-cTracer的標記策略圖
圖6. DT處理進行p16Ink4a+巨噬細胞的遺傳消融，顯著改善損傷后的肝纖維化
那p16Ink4a+內皮細胞有什么作用呢？研究人員構建了SnEC-cTracer小鼠。與p16Ink4a+巨噬細胞相反，特異性清除p16Ink4a+內皮細胞后肝臟纖維化程度加劇，表明這些細胞在限制肝損傷和纖維化過程中發揮重要作用。
圖7. DT處理進行p16Ink4a+內皮細胞的遺傳消融，在肝損傷期間加劇了肝纖維化
p16Ink4a+巨噬細胞和內皮細胞在肝纖維化中的不同作用機制為何？研究人員采用scRNA-seq技術對SnMø-cTracer和SnEC-cTracer小鼠的肝臟非實質細胞進行了深入分析。在SnMø-cTracer小鼠中，DT處理顯著改變了巨噬細胞群體的基因表達譜，上調了與免疫激活相關的通路，如促進自然殺傷細胞（NK細胞）和T淋巴細胞增殖，這提示清除p16Ink4a+巨噬細胞限制肝纖維化可能是通過改變了肝臟免疫微環境導致的。內皮細胞群體的基因表達變化表明清除p16Ink4a+內皮細胞后，肝組織向促纖維化環境轉變，成纖維細胞和間充質細胞增殖增強，提示p16Ink4a+內皮細胞抑制成纖維細胞增殖的重要作用。這些發現不僅揭示了兩種細胞類型在肝纖維化中的不同作用機制，也為開發針對肝纖維化的精準治療策略提供了新的見解。
研究團隊還利用SnEC-gTracer系統實現了在p16Ink4a+內皮細胞中過表達Kdr。在肝纖維化模型中，SnEC-gTracer小鼠肝臟中具有較多mCherry+內皮細胞，并伴隨EdU結合陽性，具有一定的細胞增殖能力，同時SASP因子表達減弱。更重要的是，纖維化標記物免疫熒光染色及天狼星紅染色結果均顯示，Kdr過表達顯著減輕了肝纖維化程度。這一發現不僅揭示了p16Ink4a+內皮細胞在肝纖維化中的新角色，還展示了通過遺傳重編程改善肝臟損傷的巨大潛力，為肝纖維化治療提供了新的策略與希望。
圖8. 文章模式圖
綜上，細胞類型特異性p16Ink4a+細胞的精準遺傳靶向是揭示其在衰老與疾病中功能的關鍵，該研究建立了體內細胞衰老的譜系示蹤及功能研究技術，開發了四種互補的遺傳策略，研究不同細胞類型中p16Ink4a+衰老細胞的體內命運與特定功能，不僅為細胞衰老與損傷再生的研究提供了新的視角和工具，也為未來精準靶向細胞衰老療法奠定了堅實的理論基礎。
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