賽默飛Stellar質譜儀在血漿蛋白質組學中的應用
生物標志物對于早期診斷疾病、監測疾病進展和評估治療反應至關重要。質譜平臺已成為該領域的強大工具，被廣泛應用于發現和定量樣本中的分析物。然而，將高分辨質譜平臺上的非靶向發現研究轉化為特定生物標志物組合的臨床檢測應用是一個富有挑戰且耗時的過程。賽默飛新型Stellar質譜儀，憑借其卓越的定性、定量分析和高通量檢測性能，全面加速生物標志物的規模轉化驗證工作流程。
富集血漿蛋白質組特征分析的靶向定量驗證轉化
研究目的
本研究案例旨在評估新型Thermo Scientific™ Stellar™ 四極桿超高速雙壓線性離子阱質譜儀PRM定量分析性能。加速將血漿蛋白質組大規模生物標志物的發現結果快速轉化為精確、可靠的臨床靶向定量檢測應用。
研究背景
● 在血漿中定量檢測生物標志物提供了一種高度可及且最小侵入性的疾病診斷方法，已被廣泛應用于各種疾病的診治過程，如早期癌癥檢測等。
● 非靶蛋白質組質譜在血漿生物標志物發現中具有巨大潛力；然而，將其轉化為針對下游驗證的靶向定量檢測可能耗時且繁瑣。
● 采用Stellar新型質譜系統使得非靶生物標志物的發現結果可以快速轉化為針對下游驗證的靶向定量檢測方法。
● 本研究開發了具有不同的通量和肽段的多種檢測方法，以評估Stellar質譜儀在驗證來自兩個大隊列生物標志物的能力（每個研究分別包含2,513名和3,000名受試者）。
● 采用Stellar 質譜儀僅在3天內完成定量檢測方法開發，60分鐘檢測約1,960個標志物（約3,920個肽）。并通過此靶向檢測方法對生物樣本隊列生物標志物的進行確證。
實驗方法
1 樣品制備和數據采集（圖1）
1）通過Proteograph™ Product Suite XT (Seer Inc.) 處理40份混合男性和女性血漿，以制得Proteograph血漿樣本。
2）通過對幾份混合血漿標準樣本進行S-trap消化，制得純血漿消化樣本。
3）制備了2,163個穩定同位素標簽（SIL）肽用于靶向定量檢測分析。這些檢測分析依據不同檢測通量和分析物數量分為三類：P100（高通量，數十個分析物），P800（中通量，數百分析物）和P2000（低通量，數千分析物）。
● 對于P100測定使用純血漿消化樣本作為背景基質，對于 P800 和 P2000 測定則使用Proteograph處理血漿樣本作為背景基質；
● 2,163個SIL肽用于P2000測定方法的開發，該檢測方法最終包含1,960個靶標；
● 所有混合物都用0.1%的甲酸和95%水/5%乙腈的緩沖液稀釋。
4）所有準備好的樣本都在Vanquish NEO液相色譜串聯Stellar質譜儀上進行數據獨立采集（DIA）或并行反應監測（PRM）采集建立靶向分析方法。
5）使用Skyline（v23.1）和PRM conductor（Skyline插件）來加速PRM檢測方法構建及數據質量評估。
2 研究數據驗證
作為驗證研究的一部分，所收集的44例（23名癌癥患者和21名非癌癥對照）血漿樣本同樣通過上述方式處理，并在NEO-Stellar MS系統上使用P2000分析。
實驗結果
■ 在3天內完成了所有檢測方法的開發，定量分析性能和檢測特異性滿足要求（圖2）。
■ 在3個不同的檢測通量條件下評估了P100檢測：100 SPD，144 SPD 和180 SPD（圖3）。雖然在所有3個檢測通量條件下都保持了定量性能，但是隨著檢測通量的增加，所測得的蛋白數量減少。
■ 該研究還調查了蛋白質組生物標志物驗證的最佳上樣量。由于其高定量重現性和靈敏度，600 ng 被確定為最佳上樣量（圖4）。
● 隨著基質質量的增加，所鑒定出的內源肽數量增加（圖4A）；
● 在寬的上樣量范圍中，Stellar 質譜儀顯示出了高定量重復性（變異系數<10%）（四次注射）（圖4B）。
■ 在完整血漿消化物中添加98個SIL肽的100 fmol數據，突顯了Stellar MS在數日血漿蛋白質組生物標志物驗證中的穩健性和可重復性（圖5）。
■ 靶向檢測方法被應用于由 23 名癌癥患者和 21 名非癌癥對照組成的生物隊列。Stellar 質譜儀成功檢測出 1,960 種 SIL 肽中的 1,913 種，證明了其能夠全面覆蓋目標肽段及臨床應用潛力。Stellar質譜平臺在幾天內表現出高度的重現性和穩定性，CV 小于 12%（圖6）。
結論
■ 使用NEO-Stellar 液相色譜串聯質譜系統開發的P100、P800和P2000檢測，顯示出了系統出色的定量性能和檢測特異性，并且整個過程僅需1 - 3天的工作量。而相比之下，使用傳統方法和三重四極桿平臺則需要數周甚至數月的時間。
■ 將P100檢測的通量提高到100 SPD、144 SPD和180 SPD，證明了Stellar 質譜儀在高檢測通量下仍保持一致的定量性能。
■ 測試了一系列Proteograph血漿上樣量，并最終選擇了600 ng的最佳基質上樣量用于蛋白質生物標志物的驗證。
■ NEO-Stellar系統在靶向蛋白質組學檢測中的穩健性、可重復性（< 12%的日間CV）和靈敏度表現，可應用于比以往技術更大規模的潛在生物標志物的高效驗證轉化。
賽默飛端到端的生物標志物靶向定量驗證工作流程
賽默飛一直致力于更好地服務開創人類健康未來的科學家，包括全新一代Thermo Scientific™ Stellar™質譜儀在內的新一代蛋白質組學工作流程，為廣大科學家們量身定制了從樣品自動制備、納流液相色譜、離子淌度到人工智能增強型數據處理軟件的無所不包的一流實驗室配置。這意味著廣大用戶在在實驗過程中，從硬件到軟件的無縫銜接，也意味著蛋白質組學從發現組學到臨床發現驗證的無縫銜接。
參考資料：
1. TRANSLATION OF PROTEOGRAPH XT NANOPARTICLE-ENRICHED PLASMA PROTEOMIC FEATURES TO A TARGETED ASSAY. Jimmy Yi Zeng,1 Philip Remes,2 Wan-Fang Chou,1 Joon-Yong Lee,1 Hao Qian,1 Cristina C. Jacob,2 Megan Mora,1 Sangeet Adhikari,1 Isabella Bonomi,1 Purva Ranjan,1 Alan Atkins,2 Scott Peterman,2 Claudia P.B. Martins,2 Philip Ma,1 and Bruce Wilcox1
2. NOVEL HYBRID NOMINAL MASS INSTRUMENT ENABLES RAPID DEVELOPMENT OF LARGE-SCALE TARGETED PLASMA PROTEOMICS ASSAYS. Jimmy Yi Zeng1, Philip Remes2, Sangeet Adhikari1, Wan-Fang Chou1, Cristina C. Jacob2, Hao Qian1, Megan Mora1, Isabella Bonomi1, Yuntao Hu1, Joon-Yong Lee1, Purva Ranjan1, Alan Atkins2, Scott Peterman2, Claudia P.B. Martins2, Philip Ma1, and Bruce Wilcox1
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