原創: 彪彪 文章來源：生物制品圈

摘要：修復和再生受損的神經組織仍然是一個重大挑戰，導致患者因恢復不完全而出現永久性功能缺陷。在新型治療策略中，使用干細胞療法的再生醫學在實驗和臨床環境中顯示出巨大的治療潛力。本章討論了干細胞分化方法和優化協議，將它們轉化為成熟的神經細胞及其策略，以振興受損的神經組織。此外，基于干細胞療法與其他新型策略（如納米技術）的組合方法將作為替代方案進行評估，以增強干細胞的治療潛力，從而獲得更好的預后。

1.引言
如今，由神經系統（NS）損傷或缺陷引起的疾病對患者和社會產生了巨大的社會和經濟影響。許多人因多種原因遭受NS損傷，包括由事故或運動創傷引起的脊髓損傷、先天性疾病或其他病理原因，如中風和神經退行性疾病。此外，缺血、自由基以及接觸化學和有毒物質也可能導致NS損傷。根據NS損傷的類型和嚴重程度，可能會出現一系列困難，如運動功能障礙、感覺或知覺缺陷或痛苦的神經病理狀況，嚴重影響患者的生活質量。此外，患有NS疾病的患者可能會遭受嚴重的情緒、認知和心理問題。周圍神經是脆弱的，可能會受傷。中樞神經系統（CNS）或周圍神經系統（PNS）損傷后的恢復過程也不同。PNS損傷可能會干擾大腦控制、協調或調節肌肉和功能的能力，并可能導致感覺、運動或兩者功能的喪失。PNS損傷還可能導致這些神經的功能障礙（周圍神經病變）。實際上，與中樞神經系統神經元不同，周圍神經系統中的神經在受傷后具有特定的自發再生能力。作為周圍神經再生中的中樞主要功能和結構細胞，許旺細胞在PNS損傷后會增殖，巨噬細胞或單核細胞吞噬受傷區域的髓鞘和軸突碎片。軸突中斷可以直接使許旺細胞從成熟的髓鞘狀態變為去分化狀態。此外，許旺細胞還分泌多種細胞因子，如白介素-1α、腫瘤壞死因子α和白血病抑制因子，以促進巨噬細胞的招募和碎片消化。此外，由許旺細胞分泌的神經營養因子，包括腦源性神經營養因子、神經生長因子和膠質細胞系源神經營養因子，促進軸突生長和神經元存活。通常，PNS損傷需要手術治療，但可能沒有令人滿意的結果。在CNS中，星形膠質細胞、少突膠質細胞和其他細胞通過在受傷部位形成厚厚的膠質瘢痕組織，阻止軸突生長和神經再生。此外，CNS中缺乏許旺細胞使損傷再生更加困難。有一些NS再生策略，如系統或局部藥物輸送、神經移植手術、利用神經導管和基因療法。但由于手術部分的不完整性和血腦屏障（BBB）的存在，這些策略受到限制，這使得藥物或治療劑進入CNS并可能產生副作用。這些限制使得傳統NS治療方法不令人滿意。因此，具有更高效率和更低并發癥的方法，如NS組織工程和細胞療法，最近引起了科學家的注意。

2.神經元類型
從形態學上講，神經元分為三類，包括（a）單極神經元，其樹突和軸突從細胞體的一個點發出，如背根神經節感覺神經元；（b）雙極神經元，其樹突和軸突從細胞體的兩個點發出，例如，嗅覺黏膜的感覺神經元；以及（c）多極神經元，其樹突和軸突從細胞體的幾個點發出，例如，運動神經元。從功能上講，神經元分為三組。第一，感覺或傳入神經元，它們對感覺系統中的特定刺激做出反應（如光、聲波或某些化學物質）；第二，運動或傳出神經元，它們將電脈沖引導至肌肉或分泌細胞；第三，中間神經元，它們是NS中數量最多的神經元，在CNS中處理信息方面有許多作用。

3.干細胞療法促進神經系統再生
干細胞療法是NS組織工程和其他組織，如心肌細胞的有希望的策略。為此，可以使用未分化和神經分化的干細胞。在以下部分中，將討論不同類型的干細胞以及在神經組織中應用這些細胞的策略。

4.神經系統再生中的干細胞類型
通過自我更新，多能干細胞可以分化成不同類型的成熟細胞，如成人神經細胞。通過干細胞療法可以利用幾種類型的干細胞進行神經組織再生。例如，胚胎干細胞（ESCs）、神經干細胞（NSCs）、成人干細胞、誘導多能干細胞（iPSCs）、骨髓基質細胞（BMSc）、皮膚源性前體干細胞、脂肪干細胞以及其他間充質干細胞（MSCs）都已用于此目的。圖1展示了iPSCs分化為神經細胞的潛力，包括神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞。干細胞類型和NS疾病或損傷對用于神經修復的干細胞命運至關重要。例如，可以分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的NSCs，可能潛在地治療帕金森病或多發性硬化癥等神經退行性疾病。然而，干細胞的生物力學和生化微環境是決定分化細胞類型的關鍵因素。

圖1 多能干細胞在神經組織再生中的潛力。該圖示比較了從胚泡內細胞團中提取胚胎干細胞（ESCs）的過程，以及如何通過山中因子的誘導從體細胞中獲得誘導多能干細胞（iPSCs）。這些多能干細胞隨后可以被引導分化為中樞神經系統（CNS）中發現的三種主要細胞類型（神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞）。

5.干細胞分化方法
有幾種方法可以將干細胞分化為神經細胞。將干細胞體外分化后再移植到缺陷或受傷區域，可以降低腫瘤形成的風險以及干細胞分化為非預期細胞類型的風險。此外，與體內相比，在培養基中控制分化更為方便。通過使用干細胞表面具有相關受體的有效信號分子，可以促進干細胞分化為神經細胞，包括細胞因子、生長因子、細胞外基質（ECM）分子和鄰近細胞的表面蛋白。為了將胚胎體分化為神經細胞，Wu Ma等人將來自人類胚胎干細胞（hESC）的胚胎體培養在包括聚-D-賴氨酸（PDL）、PDL/纖維連接蛋白、PDL/層粘連蛋白、I型膠原和Matrigel等ECM分子上。結果表明，干細胞與層粘連蛋白的相互作用促進了hESCs直接神經分化的信號通路。將干細胞培養在三維無細胞ECM上，這為細胞生長提供了適當的條件，將影響干細胞的分化。例如，在一項研究中，評估了3D ECM（由去細胞化的未分化ESC聚合體（AGG）、自發分化的胚胎體（EB）和ESC衍生的神經祖細胞（NPC）聚合體制成）對小鼠ESCs和人類iPSCs增殖的影響。結果表明，ESCs和人類iPSCs將根據3D ECM類型表現出不同的表型。使用物理刺激，如機械、熱以及磁場或電場可以影響干細胞的神經分化。在一項研究中，將極低頻電磁場（ELF-EMF；50 Hz，1 mT）應用于骨髓來源的人間充質干細胞（hMSCs）在石墨烯涂層基底上的神經分化，導致細胞粘附、分化和神經生成效率提高。使用細胞質提取物、自由基和活性氧種、遺傳調控和納米復合材料是干細胞分化為神經細胞的其他策略。

6.干細胞療法在神經組織再生中的策略
通過干細胞療法進行神經組織工程的兩個主要策略包括激活內源性干細胞和祖細胞移植。哺乳動物的中樞NS中存在內源性NSCs，它們可以增殖和分化。因此，這些內源性NSCs可以在受傷部位引導神經生成并改善神經組織再生。然而，由內源性NSCs新生成的神經元沒有成熟神經細胞的結構，導致神經組織工程并非如此成功。盡管如此，移植不同類型的干細胞被認為是至少在某些神經損傷/退行中潛在有效的治療選擇。以下將描述干細胞移植的策略。

6.1.干細胞的直接注射
在神經系統的干細胞治療中，直接注射干細胞是一種方法。在一項研究中，研究人員將2×10^6男性骨髓基質細胞（BMSc）注射到中年雌性中風大鼠的頸動脈中。BMSc的注射在中風后1天進行。BMSc注射兩周后，與對照動物相比，神經功能缺損顯著恢復。此外，瘢痕厚度顯著減少。在隨訪中，干細胞注射的效果持續存在，活BMSCs在注射后1年仍存在于缺血部位。在另一項研究中，進行了單側腰腹根撕脫，然后通過側索注射了3×10^5持續產生BDNF的MSCs。MSCs注射兩周后，手術腰腹根的運動神經元得到挽救，脊髓回路得以重建。Srivastava 等人在小鼠（C57BL/6）大腦中制造了損傷，并通過未受損的左尾部分大腦注射了表達黃色熒光蛋白的ESCs。結果顯示，ESCs遷移到大腦的損傷部位，與未注射ESCs的損傷大腦相比，ESCs處理部分的損傷大腦中基因表達增加了四倍。直接注射干細胞可以改善神經退行性疾病的治療。例如，Björklund 等人將未分化的小鼠ESCs注射到大鼠紋狀體中以治療帕金森病。作者報告稱，ESCs分化為多巴胺能（DA）神經元。此外，DA介導的運動不對稱性和異常運動行為逐漸得到修復。圖2是使用干細胞治療人類帕金森病的圖示。在一項研究中，研究人員通過脊髓內路徑，通過五次單側或五次雙側注射，向肌萎縮側索硬化癥（ALS）患者注射了10萬個胎兒來源的神經干細胞。結果顯示，接受干細胞治療的患者沒有出現顯著并發癥，通過脊髓使用干細胞是安全的。Ryu 等人表明，注射人類神經干細胞（hNSCs）可以增加亨廷頓病（HD）動物模型的運動功能，并維持宿主神經元。為了通過干細胞治療阿爾茨海默病（AD），將轉基因表達人類神經生長因子（hNGF）和增強型綠色熒光蛋白（eGFP）基因的NSCs（NSC-hNGF-eGFP）雙側注射到AD大鼠的海馬和大腦皮層。結果顯示，NSC-hNGF-eGFP改善了AD大鼠的認知功能。盡管直接注射干細胞對神經組織再生有優勢，但這種方法有一些局限性。例如，由于干細胞不可控制的命運，存在形成畸胎瘤的風險和低細胞植入率。此外，注射部位缺乏適當的細胞外基質（ECM）和必要的細胞粘附和生長因子是另一個限制因素。然而，新策略，如干細胞的鼻內應用和在細胞治療中使用支架，可能會提高神經組織再生技術的效率。

圖 2 基于干細胞治療帕金森病

6.2.基于支架的干細胞治療在神經組織再生中的應用
為了準確控制細胞的行為，體外細胞培養的條件應盡可能接近細胞和ECM的生理環境。考慮到使用支架的主要目的，即重建身體組織，每個支架都應根據目標組織的特性進行設計。它還可以引入特定的生物和機械效應以改善和改變細胞行為。除了作為細胞粘附的基質外，支架還會引起細胞遷移、生物化學因子的轉移以及營養物質的釋放。它清除細胞產生的廢物。支架必須提供一個合適的基質，以便將支架移植到缺陷區域。它可以模擬在創造細胞增殖和分化的物理和化學信號中發揮重要作用的ECM。通常，支架的形態、表面拓撲和化學性質、其微觀結構（孔隙率、大小和形狀）、親水性和疏水性以及支架制備方法影響培養細胞的行為和結構。在身體的生理狀態下，ECM包含一組交織的生物聚合物纖維，如纖維連接蛋白、膠原和明膠，其直徑為納米級，為細胞增殖和分化提供必要的基質特性。因此，許多基于這些聚合物的干細胞治療的神經組織工程支架已經制成。

一個理想的支架應具有獨特的特性。例如，它應具有足夠的孔隙率，且支架內孔的大小應均勻一致。這一特性有助于細胞更快速、更容易地替換，并促進營養物質的擴散和細胞在整個支架結構中的遷移。支架中的孔彼此相連，形成類似血液循環系統的連續通道。此外，支架必須具有良好的生物相容性，不應引起原發性和繼發性免疫反應。生物可降解性是組織工程支架的另一個必要屬性。支架的生物降解速率必須與細胞產生ECM的能力成比例。如果支架的生物降解速率過快，細胞將沒有足夠的時間制造ECM。同樣，隨著支架的破壞程度高，存活率也會較差。如果降解速率低，培養在支架上的細胞以及大量的蛋白質和細胞基質材料會對支架造成額外的負荷，支架無法承受并最終屈服并被破壞。支架的快速破壞可能會觸發身體的免疫反應（支架的使用可以克服基于干細胞的神經組織工程傳統方法的局限性。支架可以在治療過程中改善神經細胞的功能。例如，電導支架可以增強再生軸突的電指導。支架的另一個重要特性是具有適當的電荷、極性以及化學和機械屬性以支持細胞粘附、增殖和分化。此外，用于神經組織工程的支架必須具有所需的電導率。支架的特性可以根據要求和預期的應用進行優化和調整。以下將解釋不同類型的材料，包括合成和天然聚合物，這些材料可以用來制造神經組織工程支架。

6.2.1.基于水凝膠的神經組織工程支架
在不同類型的支架中，基于水凝膠的支架因其對干細胞生長、增殖和分化的有用特性而受到神經組織工程的關注。與其他類型的支架相比，水凝膠提供了更高的靈活性和易用性。此外，水凝膠可以模擬天然的ECM，提高神經組織再生的效率。在一項研究中，一種可生物降解且生物相容的三維聚（乳酸乙二醇雙酸）水凝膠（PLEOF）被五肽IKVAV修飾（IKVAV-PLEOF）。該支架被用于神經干細胞的粘附。研究結果表明，這種水凝膠為神經細胞的粘附、生長和分化提供了適當的基質。另一個例子是基于透明質酸（HA）的自聚合水凝膠，旨在提高植入干細胞的存活和分化潛力。水凝膠系統的特性可以針對腦內移植進行優化。結果顯示，基于HA的水凝膠系統增強了人神經祖細胞（iPS-NPCs）在移植到中風區域后的存活。此外，干細胞的命運可以通過使用適當的基于水凝膠的支架得到支持。Mauri 等人評估了Arg-Gly-Asp（RGD）功能化的聚丙烯酸（PAA）水凝膠對神經干細胞附著和增殖的影響。與單層（2D）細胞培養條件相比，這種水凝膠增加了接種后活躍期的細胞數量。可注射水凝膠是細胞治療中合適的干細胞載體。Wei 等人制造了一種基于多糖（N-羧乙基殼聚糖（CEC）和氧化海藻酸鈉（OSA））的生物相容自修復水凝膠。這種水凝膠被用于NSCs的遞送。所制造水凝膠的硬度與腦組織相似（100~1000 Pa）。作者報告稱，這種新型水凝膠成功支持了NSCs的增殖和向成熟神經元的分化，比例更高。在另一項研究中，設計了一種具有單向對齊微通道的3D打印水凝膠。水凝膠系統的獨特特性是它允許在水凝膠中控制生物活性分子的分布。研究結果表明，神經細胞沿著水凝膠的微通道生長，這意味著水凝膠可以以特定的排列方式指導移植的NSCs。新型可注射的二嵌段共聚肽水凝膠（DCH）包含改性L-蛋氨酸（Met）的親水段，具有穩定的機械特性，用于神經干/祖細胞（NSPC）遞送。在體外培養條件下，非離子Met-亞砜配方（DCHMO）為細胞附著提供了適當的基質。在將DCHMO注射到未受損的前腦四周后，展示了未成熟星形膠質細胞表型的發育，這表明基于Met的DCH可以作為神經組織工程中干細胞遞送的載體。水凝膠的機械特性影響干細胞生長。在一項已發表的研究中，Koser 等人評估了使用聚丙烯酰胺與層粘連蛋白水凝膠在發育中的大腦中機械特性對軸突生長的影響。體外和體內實驗評估的結果表明，神經元的生長和發展取決于周圍環境組織機械特性，以至于軸突向軟基質生長。這些數據對神經組織工程具有重要意義。Farrukh 等人開發了聚丙烯酰胺水凝膠，用聚賴氨酸（PL）和含有層粘連蛋白序列IKVAV的19肽生物功能化（IKVAV）。評估了所制造水凝膠對胚胎和成年神經祖細胞的影響。作者報告稱，與僅含IKVAV或PL的水凝膠相比，使用雙功能化水凝膠顯著改善了細胞增殖、粘附和神經發生。其他利用基于水凝膠的支架在神經組織再生中的應用實例已在表1中總結，供進一步閱讀。

6.2.2.非水凝膠基天然支架
許多天然聚合物可用于制造神經組織。包括不溶性細胞外基質(ECM)分子（例如，膠原蛋白），層粘連蛋白，纖維連接蛋白和明膠，這些在軸突發展和生長中扮演重要角色的化合物，已被廣泛用作神經組織再生的支架。殼聚糖，甲殼素和其他多糖，如海藻酸鹽和透明質酸（HA），也已被用于神經組織工程的支架制造。同樣，一些天然蛋白質，如角蛋白和絲素蛋白，也在神經組織工程中表現出高效性。在一項研究中，使用冷凍干燥法制造了多孔膠原-甲殼素支架，用于培養大鼠骨髓源性間充質干細胞（MSCs）。隨后將含有大鼠骨髓MSCs的細胞浸漬支架植入實驗性創傷性大鼠模型的受損大腦中。結果顯示，使用膠原-甲殼素支架的干細胞移植改善了創傷性腦損傷大鼠的神經病理損傷的再生。有趣的是，治療顯著降低了神經學嚴重性評分，縮短了莫里斯水迷宮的平均潛伏期，減少了受損腦組織的退化，并增加了移植腦區的血管內皮生長因子。在另一項組織工程神經通道（TENC）制造研究中，許旺細胞（SCs）和脂肪源性干細胞（ADSCs）被共培養。它們被播種在絲素蛋白（SF）/膠原蛋白支架上。該支架被植入實驗性大鼠模型的1厘米長的坐骨神經缺損中。TENCs對神經組織再生的效果在12周治療后與自體神經移植相似，但比SF/膠原蛋白支架更有效。

6.2.3.非水凝膠合成支架
在制造的支架中，合成聚合物可以輕松控制機械特性和生物可降解性的嚴重性。幾種合成聚合物已被用于基于干細胞治療的神經組織工程，包括聚α-羥基酯，如聚乙醇酸，聚乳酸，聚乳酸-羥基乙酸共聚物，聚己內酯和聚酸酐。Zhou 等人使用PLGA支架促進間充質干細胞（MSCs）的增殖和神經分化，以及神經元的粘附和生長。培養的細胞被標記為綠色熒光蛋白（GFP），并播種在PLGA支架上。作者報告說，該支架可以很好地支持MSCs和神經元的生長和遷移。此外，MSCs在PLGA支架上分化為神經細胞。在另一項研究中，活性許旺細胞（ASCs）和誘導多能干細胞（iPSCs）衍生的神經干細胞（iPSC-NSCs）被裝載在生物相容性和生物可降解的聚己內酯（PCL）支架中，用于脊髓損傷（SCI）再生。植入后，損傷腔的體積減小，SCI模型大鼠的運動功能恢復顯著改善。

7.納米技術在神經再生中的應用
具有獨特特性的納米材料，如高比表面積，為神經組織修復和治療策略提供了新的和基礎性的進步。已經證明，納米拓撲是細胞行為的指南。因此，通過將細胞相互作用導向納米尺寸，可以利用納米技術知識控制細胞行為，包括控制細胞增殖和干細胞向目標組織的分化。

7.1.納米結構改性支架
納米結構可以修改支架的機械和電學特性，使其適合用于神經組織工程。此外，通過在神經組織工程的結構中利用納米材料，支架提高了干細胞在支架上的附著、生長、增殖和分化的效率。通過使用納米顆粒（NPs），可以改變支架孔的大小和方向。因此，可以控制營養物質、生長因子和基質蛋白的進入以及細胞碎片的排出。幾種不同形狀、大小和材料的NPs可以通過干細胞治療用于神經組織再生，如金NPs，石墨烯和磁性NPs。

然而，一些類型的納米顆粒（NPs），例如銀或鈦納米顆粒，可能對神經細胞具有細胞毒性。

在最近的研究中，通過冷凍干燥法合成了金納米棒增強絲素蛋白支架（SF/GNRs），以研究PC12細胞作為神經干細胞的附著、生長、增殖和分化。結果顯示，與純絲素蛋白支架相比，這種支架增強了PC12細胞的附著和增殖，并改善了PC12細胞向成熟神經細胞的分化。此外，SF/GNRs支架具有生物相容性和可生物降解性。同樣，基于絲素的金納米復合通道被用于周圍神經組織工程。球形金納米顆粒被吸附到通過電紡絲方法制造的絲素納米復合膜上，最終通過在不銹鋼芯上滾動構建通道。許旺細胞被播種在這種支架上，并植入大鼠神經斷裂級坐骨神經損傷模型中。結果顯示，再生組織的髓鞘化顯著增加。此外，用這種支架治療的動物能夠執行復雜的運動活動。

除了金納米顆粒外，另一種納米結構已被用于神經組織工程。例如，譚丁等人開發了一種通過結合銀納米顆粒和I型膠原纖維來快速修復兔子受損坐骨神經的支架。將這種支架浸入層粘連蛋白并使層粘連蛋白附著在膠原上后，將支架植入受損區域。植入支架30天后，使用透射電子顯微鏡和電生理測試評估神經再生。結果顯示，這種類型的支架比沒有銀納米顆粒的對照膠原支架具有更多的層粘連蛋白吸收，在損傷修復期間髓鞘更厚，神經信號的傳導速度和電位幅度增加。

納米纖維/納米管支架的生產，如具有細胞生物相容性和卓越電導率的碳納米管，增加了神經元的活性。在另一項研究中，使用絲素蛋白和單壁碳納米管（SF/SWNTs）通過冷凍干燥技術制造了神經引導通道（NGCs）。研究人員證明，這些神經引導通道具有均勻的多孔結構和所需的電導率。此外，通過電紡絲程序在SF/SWNT通道結構內制造了含有纖維連接蛋白（FN）的納米纖維。結果顯示，纖維連接蛋白在這些通道中保持生物活性并改善細胞附著。然后將神經引導通道植入10毫米神經損傷的大鼠中。5周后，他們觀察到SF/SWNT/FN神經引導通道具有生物相容性，并且高度能夠再生神經組織。Koh 等人通過結合聚（L-乳酸）（PLLA）和層粘連蛋白制備了納米纖維支架。通過共價結合、物理吸附或電紡絲過程進行支架的層粘連蛋白修飾。評估PC12細胞活性和測量神經細胞在支架上的生長表明，這些支架增加了神經細胞增殖，并能夠模仿細胞外基質，促進神經組織再生。

7.2.用于穿越血腦屏障的納米顆粒藥物運輸
中樞神經系統（CNS）損傷再生的另一種策略是治療劑和干細胞遞送。然而，血腦屏障（BBB）保護中樞神經系統，嚴格控制一系列分子的交換。血腦屏障是大腦抵御病原體的保護屏障，除了在藥物和基因遞送策略中阻止許多治療分子和基因的進入。因此，血腦屏障被認為是細胞治療中樞神經系統再生失敗的因素之一。

研究表明，脂溶性、非常小的低分子量分子（低于400-500道爾頓）可以穿過血腦屏障。此外，如激素等特殊分子可以穿過血腦屏障。特定的轉運蛋白對于將較大的營養物質、離子和大分子穿過血腦屏障至關重要。通常，分子遵循兩條途徑穿過大腦；分子通過擴散由于脂溶性或通過催化轉運穿過血腦屏障。

不同類型的NPs可以增強治療劑穿越血腦屏障進入大腦的轉移，包括金屬NPs，特別是金NPs，脂質NPs包括脂質體，固體脂質NPs，基于聚合物的NPs包括聚乙醇酸，聚乳酸，聚乳酸-羥基乙酸共聚物，膠束聚合物NPs，和樹枝狀聚合物。Roger 等人將骨髓間充質干細胞與紫杉醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒融合以治療膠質瘤。作者報告說，這些NPs對細胞的活性和分化影響微不足道。細胞給藥后兩天，追蹤了載有NPs的熒光標記MSCs。結果表明，載有NPs的MSCs向人類膠質瘤異種移植物遷移。

8.結論
由于神經系統的復雜性和瘢痕病變的形成，治療神經損傷和神經病變存在許多挑戰。如神經自體移植手術等治療策略，對神經組織的再生有限，并引起嚴重的副作用。干細胞基礎的神經組織工程等新的治療方法可以改善NS缺陷和疾病的修復。同時使用納米技術與干細胞治療可以提高治療效果。這些策略對于治療神經損傷患者和減輕他們的痛苦是有希望的。