超分辨顯微成像技術自誕生以來，憑借其優異的納米級空間分辨率，已成為生命科學研究中精準揭示復雜生命現象的重要成像技術。

其中，基于單分子定位的超分辨成像策略，使得定位、觀察、研究單個探針分子獨特的理、化、光學性能成為可能。偏振作為熒光信號的一個重要特性，近年來伴隨著單分子三維取向成像技術的發展，逐步在單分子成像和超分辨領域中展示出諸多新穎且重要的應用特性。

國家納米科學中心中國科學院納米生物效應與安全性重點實驗室的趙睿航，盧晉團隊總結了單分子三維取向超分辨成像技術的最新進展，介紹并分析了兩類主要的單分子三維取向熒光顯微技術——基于熒光吸收與輻射偏振調制的單分子三維取向成像方法以及利用點擴散函數工程將單個熒光分子的三維取向信息編碼到熒光圖像上的成像策略。

超分辨熒光成像技術概述
超分辨熒光成像技術主要分為三類�；�于單分子定位的超分辨顯微（SMLM）技術分辨率高，但成像時間長、時間分辨率差；結構光照明顯微成像（SIM）技術成像速度快、光子利用率高、適用染料多，但分辨率有限；受激輻射損耗（STED）超分辨顯微技術可提升分辨率，但存在光毒性和光漂白問題。此外，還有最低光子通量（MINFLUX）超分辨成像策略，具有較高定位精度和成像分辨率。

在生物研究中，生物大分子的微觀結構和分子間相互作用變化在取向角度域有顯著變化，單分子三維取向超分辨成像技術有助于深入闡釋生命過程機制。

單分子三維取向成像技術
一、基于熒光吸收與輻射偏振調制的方法

1、技術原理

利用熒光分子吸收與輻射過程中偏振特性，通過在激發光路加入偏振調制模塊，分析不同偏振方向激發光吸收效率及熒光發射信號偏振方向，獲取單分子三維取向信息。如單分子熒光偏振（SMFP）技術，交替用平行和垂直偏振光激發樣品，經偏振分光棱鏡分路接收熒光信號，分析強度擬合取向和動力學信息。

2、研究案例

對肌動蛋白和S-DNA構象研究，通過熒光偏振顯微技術測量取向變化，確定分子取向信息。

3、技術局限

線偏振激發調制要求單分子常亮且取向固定，與SMLM結合時需篩選常亮單分子，效率受限；僅對發射信號偏振分光成像雖便捷但難同時獲取多未知參數，適用于有取向分布先驗信息的樣品。
 

二、基于PSF工程的方法

1、單分子三維取向對SMILM定位精度的影響及校正
單分子三維取向會使定位結果產生偏差，可通過設計“y-phi”掩模等方法消減偏差光子提升定位精度。

2、高焦成像策略
離焦成像可展示單分子取向差異，但會增加PSF尺寸、降低信噪比和定位準確性；利用最大似然估計從單分子PSF圖樣獲取取向信息，但對軸向分量不敏感。

3、傅里葉面調制策略

• CHIDO方法：使用雙折射掩模編碼PSF，通過應力工程光學器件產生雙折射圖案，經四分之一波片和沃拉斯頓棱鏡分離成右旋圓（RHC）和左旋圓（LHC）PSF，可攜帶定位取向信息，對單分子三維取向和位置檢測能力強。

• Vortex PSF技術：在共軛后焦平面加入渦旋相位板獲得 Vortex PSF，可確定分子三維位置、取向和擺動信息，精度高、信噪比高，形狀對極角和方位角敏感，可用于解析熒光探針與樣品相互作用。

4、基于傅里葉面調制的單分子顯微成像系統性策略
以傅里葉光學為理論框架，將偶極子信息編碼到單分子熒光圖像，如SMOLM技術可實現單分子三維取向與定位同時成像；后續研究不斷發展該技術，如利用NR對磷脂膜成像揭示其對化學成分響應，將Vortex PSF應用于SMOLM對雙層脂膜成像剖析生物樣品結構特征，提出raPol顯微鏡及raMVR顯微鏡提高檢測率和精度，實現對多種生物樣品的成像研究。

應用于活細胞或單顆粒的超分辨取向成像技術
1、超分辨偶極取向映射（SDOM）方法
通過調制偏振激發光解析熒光偶極子取向，亞衍射極限分辨率，成像速度快，適用于活細胞成像。

2、偏振SIM（pSIM）技術
結合熒光偏振調制和結構光照明技術，可解析生物分子取向與結構信息，與三維SIM結合實現快速偏振三維SIM（polar-3DSIM）成像。

3、光譜和偏振光學層析成像（SPOT）技術
從熒光強度、光譜和偏振三個維度解析膜信息，用于活細胞亞細胞尺度脂質組學研究，可實時監測細胞活動。

4、單分子熒光偏振顯微鏡在單顆粒催化成像中的應用
用于納米限域效應的單分子三維取向研究，解釋了納米催化劑上的催化活性現象。

總結與展望
單分子三維取向成像技術在解析生物樣品納米尺度結構與有序度、生物大分子構象等方面具備獨特優勢，但其廣泛應用面臨諸多挑戰。

在熒光標記策略上，現有方式難以確保熒光探針與生物大分子取向關系，如基于不同原理的 SMOLM 技術均存在各自問題；在單分子熒光亮度或成像信噪比方面，成像策略會降低信噪比，但已有優化篩選熒光探針提升信噪比的嘗試；活細胞成像受多種因素影響困難重重，雖可借鑒相關方案且深度學習提供新思路，但復雜微環境仍增加了解析難度；多色成像或波長維度拓展是應用于復雜生命過程研究的趨勢。

不過，隨著技術發展，該技術在提升成像精準度、推進應用廣度和深度等方面前景依然廣闊。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：趙睿航, 盧晉. 單分子三維取向超分辨成像技術進展（特邀）[J]. 激光與光電子學進展, 2024, 61(6): 0618015. Ruihang Zhao, Jin Lu. Three-Dimensional Orientation and Localization Microscopy of Single Molecules Using Super-Resolution Imaging Technology (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618015.