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豬作為主要的肉類來源和人類疾病的理想模型，其肌肉發育研究對于農業和生物醫學都至關重要。商業品種（commercial breeds，瘦肉型）和本土品種（indigenous breeds，肥胖型）之間在肌肉生長上存在顯著的表型差異，為鑒定肌肉發育中的關鍵基因和通路提供了絕佳模型。盡管已經在轉錄水平上對豬肌肉進行了廣泛的測序研究，但針對轉錄后調控，尤其是表觀遺傳修飾的高通量測序研究仍然較少。m6A作為真核生物mRNA中最豐富的轉錄后修飾，幾乎調控mRNA代謝的所有方面，包括轉錄、pre-mRNA處理、翻譯和降解。m6A修飾由一組“writers”酶復合體催化，包括甲基轉移酶樣3（METTL3）、METTL14、Wilms腫瘤相關蛋白（WTAP）和ZC3H13。m6A修飾可以由“erasers”酶如FTO和ALKBH5動態可逆。m6A修飾通過多種機制促進mRNA翻譯。在mRNA穩定性調控方面，m6A主要通過YTHDF2促進mRNA降解。近期研究發現m6A的替代作用，即IGF2BP蛋白介導其增強mRNA穩定性和保守功能。

近日，湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所助理研究員顧浩博士為第一作者、湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/湖北省洪山實驗室畢延震研究員和中國科學院亞熱帶農業研究所印遇龍院士為共同通訊在《cells》雜志發表了題為“N6-Methyladenosine RNA Modification Regulates the Differential Muscle Development in Large White and Ningxiang Pigs”的研究論文，研究了N6-甲基腺苷（m6A）RNA修飾在大約克豬（Large White, LW）和寧鄉豬（Ningxiang, NX）肌肉發育差異中的調控作用。研究通過MeRIP-seq技術揭示了m6A甲基化模式，并發現m6A修飾在肌肉細胞發育、肌原纖維、細胞周期和磷酸酶調節活性等方面對肌肉發育的新生兒階段具有調控作用。特別地，研究指出m6A修飾通過YTHDF2依賴性方式加速了特定肌肉特異性跨膜蛋白WFS1降解，并鑒定出一個單核苷酸多態性（SNP）位點C21551T，該位點在WFS1基因的最后一個外顯子中，導致LW和NX豬中WFS1表達水平的差異。
 

本研究鑒定了大約克豬（Large White, LW）和寧鄉豬（Ningxiang, NX）不同品種新生仔豬肌肉發育過程中的差異表達基因，并通過MeRIP-seq繪制了m6A甲基化模式。研究結果表明，m6A修飾在肌肉發育的新生仔豬階段調控肌肉細胞發育、肌原纖維、細胞周期和磷酸酶調節活性。且LW和NX豬中差異表達基因主要富集在參與蛋白質合成通路中。對MeRIP-seq和RNA-seq數據進行聯合分析，共鑒定出27個差異表達且m6A修飾基因。還鑒定出一種典型的肌肉特異性包膜跨膜蛋白WFS1，在LW和NX豬中通過m6A修飾被差異調控，進一步揭示了m6A修飾以YTHDF2依賴方式加速了WFS1降解。最后鑒定了WFS1最后一個外顯子中的C21551T導致m6A甲基化變化，從而影響LW和NX豬中的WFS1表達水平差異。本研究對NX和LW豬在新生仔豬肌肉發育期間的m6A修飾進行了全面分析，并闡明了m6A修飾對這兩個品種WFS1差異表達的調控機制。

圖1：5日齡NX豬和LW豬背最長肌特征。

圖2：m6A修飾參與調控肌肉發育。

1. qPCR實驗檢測NX和LW豬肌肉中與m6A相關基因的表達水平。
2. 代表性NX和LW豬背最長肌切片中FTO（綠色）圖像；DAPI用于核染色（藍色）。
3. Western blotting實驗結果表明，在LW豬肌肉中FTO表達水平升高，METTL4表達水平降低。
4. 使用ImageJ軟件對m6A水平進行定量分析。
5. Western blotting實驗結果表明，在分化后第0、2和4天，豬衛星細胞（PSCs）中FTO蛋白表達顯著增加。
6. Myhc免疫熒光染色顯示，FTO過表達顯著增加了Myhc+細胞比例，而FTO敲低顯著減少了Myhc+細胞的比例（n = 3）。* p < 0.05，** p < 0.01。

圖3：mRNA m6A甲基化在LW和NX豬肌肉中的整體特征。

1. 檢測NX和LW豬肌肉中m6A修飾工作流程。通過免疫沉淀(IP)純化含m6A的mRNA片段。
2. 每組m6A peaks的平均數量。
3. 沿轉錄本的m6A peaks密度。
4. LW和NX豬肌肉中m6A富集的共有motifs。
5. NX-1豬染色體上m6A富集區域分布。

F-G. (F) GO和(G) KEGG富集分析，在NX-1豬肌肉樣本中有2035個基因發生m6A修飾。

圖4：LW和NX豬肌肉之間差異性m6A修飾的比較。

1. LW和NX豬肌肉之間差異性m6A修飾基因火山圖
2. 染色體上富集區域中差異性m6A修飾基因分布。

C-D. mRNA區域中顯著差異m6A peaks分布。

E. KEGG富集分析顯示LW與NX豬肌肉中差異性上調的m6A修飾基因。

F. KEGG富集分析顯示LW與NX豬肌肉中差異性下調的m6A修飾基因。

圖5：LW和NX豬骨骼肌的mRNA中差異表達水平。

1. 差異表達的mRNA基因火山圖。
2. 差異表達的mRNA基因分層聚類分析。
3. qPCR結果顯示LW豬中上調的mRNA表達。
4. qPCR結果顯示LW豬中下調的mRNA表達。
5. 通過GO分析富集的前30個差異表達基因通路。
6. 通過KEGG預測富集的前30個差異表達基因通路。* p < 0.05，** p < 0.01。

圖6：RNA-Seq和MeRIP-Seq的綜合分析。

1. 差異性m6A甲基化和mRNA表達變化的peaks數量韋恩圖。
2. 四象限圖展示基因分布情況。不同顏色表示RNA表達或m6A甲基化水平不同變化。
3. 熱圖顯示了27個甲基化水平有顯著差異基因的表達情況。
4. IgG作為陰性對照，通過MeRIP-qPCR驗證5個m6A甲基化基因。
5. qPCR分析顯示，與NX豬相比，LW豬中5個高表達上調基因的表達增加。
6. 在SH3BP4基因位點上，IGV可視化顯示RNA-seq（灰色）數據和MeRIP-seq（紅色和藍色）數據。

圖7：m6A修飾調控NX和LW豬肌肉中WFS1的差異表達。

1. 基因組瀏覽器軌跡顯示WFS1基因位點的RNA-seq（灰色）和MeRIP-seq（藍色和綠色）數據。
2. MeRIP-qPCR驗證WFS1的m6A修飾。IgG作為陰性對照。
3. 檢測LW和NX豬肌肉中WFS1的表達。
4. 用FB23-2或DMSO處理的PSCs中WFS1 mRNA表達的RT-PCR分析。
5. 檢測用FB23-2或DMSO處理的PSCs中WFS1 mRNA降解率。
6. 在干擾YTHDF2后，檢測DMSO和FB23-2處理組中WFS1的表達。
7. 兩個品種仔豬共6個樣本在m6A結合peaks序列和SNP位點的測序結果。
8. m6A結合peaks的SNP位點的雙熒光檢測。包含C或T的結合片段被克隆到pmirGLO質粒中，分別命名為pmirGLO-MutC和pmirGLO-MutT（上圖）。然后，它們與陰性對照空載體（pmirGLO-WT）一起轉染入PSCs，隨后用FB23-2處理（紅色+/−）。