畢赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）作為工業應用蛋白質生產最為常見酵母物種之一，已被成功應用于1000多種外源蛋白質的表達^[1]。目前發酵過程中測定菌體生長主要采用OD600、干濕稱量法等無法精確的反應酵母的具體細胞數目，傳統的平板菌落計數則需要36h的培養時間^[2-3]。本文采用CytScop^®mini設備針對畢赤酵母進行參數優化，提供快速、準確的畢赤酵母AOPI計數新方案。
測試樣本及儀器設置參數

• 畢赤酵母：母液濃度約20×10⁶ cells/mL。
• 畢赤酵母儀器測試參數
• 細胞類型名稱：AOPI-畢赤酵母
• 畢赤酵母樣本儀器測試參數

稀釋及取樣
按照ISO6887-1:2017提供的倍比稀釋指南，對樣本母液進行連續稀釋，得到6個稀釋梯度：1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125，每個濃度梯度取3個平行，上機測試。
計數結果分析
變異系數（C.V）是衡量各觀測值變異程度的一個統計量，常常用來反映一組數據的離散程度，在儀器的測量中可以用來反映儀器測量的精確性。C.V值越小，說明儀器測試數據離散程度越小，儀器的重復性越好，精確度越高。如下表1所示，畢赤酵母樣品測試數據的C.V均值為3.47%。
表1 畢赤酵母實驗原始數據及計算結果  
比例指數（PI）（引自ISO 20391-2）是用來量化細胞計數方法符合比例原則的程度，偏離比例性的情況說明測量存在系統性或非系統性誤差，從而導致測量精度損失。PI值越小，說明儀器測試越接近比例原則，儀器精確度越高。如表1所示，本次細胞測試的PI為0.714。
對畢赤酵母結果進行線性擬合分析，結果如圖2所示。   如圖3所示，在不同濃度下畢赤酵母都有較好的熒光成像效果。  
如圖4所示，畢赤酵母不同稀釋梯度下能很好的被CytScop®mini識別標記，畢赤酵母具有高識別率。
對各稀釋濃度活率進行統計計算，結果如圖5所示。 結論
為驗證CytScop^®mini對畢赤酵母AOPI染色下計數的精確度和準確度采用倍比稀釋法進行測試。
在不同畢赤酵母稀釋比例下均有較低熒光背景和清晰的細胞熒光，明場標記圖像有良好的細胞識別率。
倍比稀釋結果顯示，6組不同稀釋比例C.V均<10%，平均C.V=3.47%，線性回歸R²=0.995，PI=0.714，體現了CytScop^®mini采用AOPI染色對畢赤酵母計數有良好的準確度和精密度。
綜上，通過采用AOPI對畢赤酵母染色，在0.8-20M密度范圍計數有良好的準確度和精密度。

參考文獻
[1]茹扎·也里扎提,楊宇. 畢赤酵母中外源蛋白表達量的提升策略_茹扎·也里扎提[J]. 生物技術通報, 2024, 40(03): 118-134.
[2]方曙光,黃立,儲炬,等. 流式細胞儀檢測重組畢赤酵母發酵過程中的細胞活性_方曙光[J]. 華東理工大學學報(自然科學版), 2006, (09): 1046-1049.
[3]張景宵. 畢赤酵母生長過程中的圖像分析技術初步研究_張景宵[D]. 江南大學, 2023.