腫瘤微環境作為癌癥發展進程中的關鍵角色，其內部的復雜機制一直是科研人員聚焦的重點。一項發表于《Communications Biology》的研究成果，借助組織透明化技術，為我們開啟了深入了解腫瘤微環境的全新窗口，這一突破在癌癥研究領域掀起了新的波瀾。

研究背景與技術挑戰
腫瘤微環境由癌細胞、各種非轉化的基質細胞（如成纖維細胞、內皮細胞、免疫細胞等）以及細胞外基質組成。在腫瘤的發生、發展過程中，癌細胞與腫瘤微環境之間存在著復雜的相互作用。癌細胞可誘導腫瘤微環境發生改變，促進腫瘤血管生成、免疫逃逸等，而腫瘤微環境又為癌細胞提供營養物質、生長信號，幫助癌細胞侵襲和轉移。

傳統研究腫瘤微環境的方法存在諸多局限性。在體內研究方面，由于組織的不透明性，很難對腫瘤微環境進行整體、動態的觀察。現有的成像技術，如磁共振成像（MRI）、計算機斷層掃描（CT）等，雖然能提供宏觀的解剖學信息，但分辨率不足以觀察細胞和分子水平的變化，而顯微鏡技術雖然分辨率高，但觀察深度有限，難以對深層組織進行成像。因此，開發一種能夠突破這些限制的技術，對于深入理解腫瘤微環境的機制、推動癌癥治療的發展至關重要。

技術創新與應用
該研究團隊對組織透明化技術進行了創新和優化。組織透明化技術旨在使不透明的組織變得透明，從而實現對組織內部結構的三維成像。研究人員通過大量的化學篩選，開發出了一套新的組織透明化方案，使用了三種組織透明化試劑：CUBIC-P−、CUBIC-L和CUBIC-R+。

CUBIC-P−主要用于組織的脫色，它能有效去除組織中的色素，減少光吸收，使組織更易于透明化處理。CUBIC-L具有脫色和脫脂的雙重功能，它可以去除組織中的脂質成分，進一步提高組織的透明度。CUBIC-R+則用于調節組織的折射率，使組織的光學性質更均勻，減少光散射，從而提高成像質量。這三種試劑協同作用，能夠在一天內實現小鼠多個器官（如肺、胰腺、脾臟等）的透明化，大大縮短了實驗周期。與以往的組織透明化方法相比，新方案不僅效率更高，而且對組織的損傷更小，能夠更好地保持組織的原有結構和生物學特性。

為了實現對腫瘤微環境的全面分析，研究人員將組織透明化技術與三維成像技術相結合。他們使用定制的光片熒光顯微鏡對透明化的組織進行成像，能夠在不損傷組織的情況下，對整個器官進行高分辨率的三維成像。為了覆蓋整個器官，顯微鏡的載物臺可以在橫向和軸向移動，同時檢測物鏡也會同步移動，以避免失焦。不同波長的激光可以激發不同的熒光標記，從而實現對多種細胞成分的同時成像。通過這種方式，研究人員能夠獲取腫瘤微環境中各種細胞和分子的三維空間信息。

為了更準確地分析三維成像數據，研究人員引入了機器學習技術。基于機器學習的方法，如使用ilastik軟件進行像素分類，能夠更準確地識別不同的細胞成分。研究人員首先對圖像中的像素進行手動標注，將其分為真實信號、Z軸信號泄漏、強自發熒光和背景熒光等不同類別。然后，ilastik軟件根據這些標注的像素特征，計算每個像素屬于不同類別的概率。通過這種方式，能夠更準確地對腫瘤微環境中的多種細胞成分進行分割和分析，避免了傳統方法中因閾值設定不當而導致的誤差。

成像實驗與結果分析
利用優化后的組織透明化和成像技術，對小鼠實驗性肺轉移模型進行了深入研究。將人肺腺癌細胞通過靜脈注射的方式接種到裸鼠體內，建立了肺轉移模型。在不同時間點，對小鼠的肺部進行組織透明化處理和免疫染色，使用針對不同細胞成分的抗體。

通過三維成像，清晰地觀察到了腫瘤微環境中各種細胞成分的空間分布。發現癌細胞在肺部形成了轉移性定植，并且與腫瘤微環境中的多種細胞緊密相鄰。通過測量癌細胞與不同細胞成分之間的距離，研究人員發現33%的癌細胞距離α-SMA陽性血管在10μm以內，24%的癌細胞距離VEGFR3陽性血管在10μm以內。這表明癌細胞與血管系統之間存在著密切的聯系，血管可能為癌細胞提供了營養和轉移的途徑。還觀察到腫瘤微環境中的巨噬細胞和血小板也與癌細胞存在著相互作用，這些細胞的分布與癌細胞的轉移定植可能密切相關。

轉化生長因子-β（TGF-β）是一種多功能細胞因子，在腫瘤的發展過程中具有復雜的作用。通過實驗探究了TGF-β對癌細胞轉移定植的影響，將TGF-β刺激和未刺激的癌細胞按照不同比例混合后注射到小鼠體內。結果發現，當混合注射TGF-β刺激和未刺激的癌細胞時，未刺激癌細胞的轉移性定植數量明顯增加。當未刺激癌細胞與TGF-β刺激癌細胞混合注射時，GFP陽性（未刺激癌細胞標記）的菌落數量比單獨注射未刺激癌細胞時更多。這表明TGF-β刺激的癌細胞能夠促進未刺激癌細胞的轉移定植。

為了探究TGF-β刺激的癌細胞促進未刺激癌細胞轉移定植的機制，研究人員進行了RNA測序分析。結果顯示，TGF-β刺激癌細胞后，與凝血和炎癥相關的基因表達上調。進一步的研究發現，TGF-β刺激的癌細胞能夠激活腫瘤微環境中的血小板和巨噬細胞。通過抗體標記和成像分析，研究人員觀察到TGF-β刺激的癌細胞與血小板和巨噬細胞的共定位增加。在血小板實驗中發現，TGF-β刺激的癌細胞周圍血小板的聚集明顯增多。在巨噬細胞實驗中，通過細胞因子陣列分析發現，TGF-β刺激的癌細胞能夠促使肺部產生多種炎癥細胞因子和趨化因子，這些因子能夠激活巨噬細胞并促進其向腫瘤微環境遷移。

深遠意義與未來展望
研究借助創新的組織透明化技術，深入剖析了腫瘤微環境，為理解腫瘤發展機制提供關鍵依據。理論上，揭示了TGF-β重塑腫瘤微環境的機制，以及癌細胞與血小板、巨噬細胞的相互作用關系，加深了我們對腫瘤生物學的認知。實踐中，研究成果為癌癥治療提供新靶點，針對TGF-β信號通路、血小板或巨噬細胞的干預，有望成為抑制腫瘤轉移的新策略，比如開發TGF-β抑制劑，或調節血小板、巨噬細胞功能來阻止癌細胞轉移定植。

在未來研究可將組織透明化技術與基因編輯、蛋白質組學、代謝組學等前沿技術深度融合。利用基因編輯修飾特定基因，探究其在腫瘤微環境中的功能，結合蛋白質組學和代謝組學，分析蛋白質與代謝物分布變化，多層面揭示腫瘤發展本質。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：Kubota, S.I., Takahashi, K., Mano, T. et al. Whole-organ analysis of TGF-β-mediated remodelling of the tumour microenvironment by tissue clearing. Commun Biol 4, 294 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-01786-y.