文獻信息
同濟大學醫(yī)學院施劍林院士團隊及其附屬上海市第十人民醫(yī)院骨科等團隊的研究成果Hydrolysis of 2D Nanosheets Reverses Rheumatoid Arthritis Through Anti-Inflammation and Osteogenesis (2D納米片原位水解通過抗炎和成骨治療類風濕性關節(jié)炎) 在學術期刊《ADVANCED MATERIALS》 (IF：27.4) 上發(fā)表。平生公司的離活一體CT (NEMO) 在論文中提供了重要的小鼠踝關節(jié)、兔子膝關節(jié)圖像和定量分析結果。

該論文的通訊作者為同濟大學醫(yī)學院霍敏鋒研究員和吳鵬副教授，第一作者為同濟大學醫(yī)學院冀鵬豪博士生。

文獻摘要
類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種關節(jié)功能障礙的炎癥疾病。臨床上，針對RA的藥物僅側重于減輕局灶性炎癥，而不考慮骨微環(huán)境的促成骨重建。在本研究中，通過簡單的液相剝離制備了二維層狀二硅化鈣納米片(CSNs)。CSNs的水解產生抗氧化H₂、堿性Ca(OH)₂和二氧化硅。這些部分在抗氧化、抗炎和促骨生成中起著重要作用，導致比單獨抗炎更好的RA治療效果。氫氣被證實可以消除過量的羥基自由基并調節(jié)巨噬細胞的再極化；生成的Ca(OH)₂可以中和酸性微環(huán)境并抑制破骨細胞活性；而且，溶解的Ca²⁺可以有效地與磷酸鹽復合，礦化成Ca₃(PO₄)₂，促進病灶關節(jié)的成骨。

實驗方法
佐劑誘導的關節(jié)炎（AIA）小鼠和兔模型
20只雌性Balb/c小鼠（6周齡）隨機分為四組（N=5）。第一組被選為對照組，不進行任何治療。另一組在小鼠右后踝關節(jié)注射25μL CFA，建立AIA模型。同時，左后踝關節(jié)注射相同體積的PBS。每三天用游標卡尺記錄踝關節(jié)的寬度。計算右關節(jié)與左關節(jié)的寬度比，以評估關節(jié)腫脹程度。

 為了建立AIA兔模型，將20只兔子隨機分為四組（N=5）。第一組被選為對照組，不進行任何治療。其他組通過反復注射卵清蛋白（OVA）和CFA進行免疫接種。簡而言之，將OVA溶解在PBS（20 mg mL^-1）中，并與等體積的CFA混合。然后在4°C下將混合物完全乳化。每周在背部皮下的五個部位注射1mL乳液對兔子進行免疫接種，持續(xù)3周。在第三周和第四周，將混合的OVA/CFA乳液注射到雙側膝關節(jié)中（每膝0.5mL），以誘導AIA兔模型。
 AIA小鼠關節(jié)炎治療的體內評估：三組AIA小鼠（N=5）分別關節(jié)內注射25μL PBS或等體積含CSNs（3 mg kg⁻¹）或DMP（10 mg kg⁻¹）的PBS。每3天測量一次體重和踝關節(jié)寬度。評估3周后，處死所有小鼠并收集踝關節(jié)組織。通過RT-PCR分析評估促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎細胞因子（CD206和IL-10）的水平，并通過顯微CT（平生醫(yī)療科技有限公司）掃描評估組織形態(tài)計量學。還量化了關節(jié)的組織形態(tài)計量學參數(shù)（Tb.Sp和Tb.BMD）。
 

AIA兔關節(jié)炎治療的體內評估：三組AIA兔（N=5）分別關節(jié)內注射500μL PBS或等體積含CSNs（3mg kg⁻¹）或DMP（10mg kg^−L）的PBS。每三天測量一次體重和踝關節(jié)寬度。1周內兩次給藥后，通過MRI記錄膝關節(jié)的病理過程。評估期結束后，處死關節(jié)炎兔和正常兔，收集膝關節(jié)組織。通過ELISA評估促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）和抗炎細胞因子（IL-10）的蛋白質水平。通過顯微CT（平生醫(yī)療科技有限公司）掃描評估組織形態(tài)計量學，并量化關節(jié)的組織形態(tài)計量參數(shù)（Tb、Sp和Tb、BMD）。

實驗結果
采用佐劑誘導性關節(jié)炎（AIA）方法建立RA小鼠模型。具體來說，雌性Balb/c小鼠在右后踝關節(jié)內注射完全弗氏佐劑（CFA），然后免疫5天，導致關節(jié)明顯腫脹（圖6a；）。將15只關節(jié)炎小鼠隨機分為三組（N=5），關節(jié)內注射PBS或等體積的含CSN或地塞米松磷酸鈉（DMP，臨床批準的藥物）的PBS。另取5只未注射佐劑的健康小鼠作為對照組。DMP治療組的小鼠體重略有下降，而其他組的小鼠在評估期的27天內體重沒有明顯波動，這可能是由于DMP的副作用造成的（圖6c）。在對照組和DMP治療組的小鼠中觀察到可忽略或中等的治療效果。CSNs組踝關節(jié)腫脹明顯減輕（圖6b）。在治療終點拍攝的照片清楚地顯示，與對照組和DMP組相比，CSNs組的踝關節(jié)腫脹明顯減輕，與聯(lián)合測量結果一致（圖6d）。顯微CT掃描圖像顯示，與正常組相比，關節(jié)炎組小鼠的踝關節(jié)有明顯的骨侵蝕。CSNs和DMP均顯著改善了骨侵蝕，驗證了CSNs的高療效（圖6e）。基于顯微CT分析的骨微觀結構的組織形態(tài)計量學參數(shù)，如小梁骨礦物質密度（Tb.BMD）和小梁間距（Tb.Sp），表明CSN治療后RA關節(jié)的骨顯微結構與健康關節(jié)相似，這歸因于CSN的強大抗炎和促生物礦化作用（圖6f，g）。

圖6. CSNs對AIA小鼠抗RA療效的評價。a） 小鼠AIA模型建立和治療方案的示意圖。b） c）受不同治療的小鼠的體重曲線。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（N=5）。d） 不同組別小鼠踝關節(jié)的代表性照片。e） 在第27天，來自不同組的小鼠右踝關節(jié)的代表性3D重建顯微CT圖像。第27天不同組小鼠右踝關節(jié)骨微觀結構的組織形態(tài)學顯微CT分析[f）Tb.BMD和g）Tb.Sp]。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（N=4）。h） mRNA（IL-6、IL-10、TNF-α、TNF-α）的相對表達，CD206）。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（N=4）。i） 不同組別小鼠右踝關節(jié)的代表性H&E染色、賽峰紅固定綠染色、ALP和TRAP染色圖像。

顯微CT分析的結果提供了股骨脛骨軟骨下骨結構的信息（圖7e）。從不同角度（如冠狀面、正中矢狀面和橫斷面）對膝關節(jié)進行計算重建，清楚地表明RA組兔子的股骨脛骨軟骨下骨受到侵蝕。CSN治療通過抗炎和釋放生物礦化物質（無定形磷酸鈣和二氧化硅）逆轉了兔子的RA進展。DMP對家兔的抗炎治療和RA逆轉作用效果有限。股骨脛骨軟骨下骨微觀結構的組織形態(tài)計量學參數(shù)，如Tb.BMD和Tb.Sp用于定量分析RA關節(jié)的骨微觀結構（圖7f，g）。與顯微CT重建圖像一致，由于CSN具有強大的抗炎和探針礦化作用，CSN治療后的骨參數(shù)與健康關節(jié)的骨參數(shù)相似。

圖7.CSNs對AIA兔抗RA療效的評價。a）兔AIA模型建立和治療方案示意圖。b）不同組別家兔膝關節(jié)周長的時間依賴性。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（N=5）。c） 紅外熱成像圖像和d）不同組別兔子膝關節(jié)的焦點溫度。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（N=5）。e）在第70天，不同組別兔子膝關節(jié)的代表性3D重建顯微CT圖像。不同組別兔膝關節(jié)骨微觀結構的組織形態(tài)計量顯微CT分析[f）Tb.BMD和g）Tb.Sp]。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（N=3）。h）TNF-α，i） IL-6和j）在第70天從不同組的兔關節(jié)獲得的滑液的IL-10。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（N=3）。

使用結論
總之，通過簡單的液相剝離方法成功合成了2D納米片CSN，通過其水解產物——抗氧化/抗炎H₂氣體和堿性Ca(OH)₂治療類風濕性關節(jié)炎，這些產物抑制破骨細胞活性，并通過CSN中的Ca²⁺溶解促進CAP礦化實現(xiàn)促成骨作用。制備的CSN尺寸為280nm，RA的酸性微環(huán)境會加速水解反應，水解產生的Ca²⁺原位礦化成CAP促進骨修復。CSNs的抗氧化、抗炎、促成骨和抗破骨的作用在體外得到驗證。從機制上講，病灶的巨噬細胞的復極化在CSNs治療RA中起著關鍵作用，這是通過納米材料產生的氫氣消耗過量ROS和恢復炎癥穩(wěn)態(tài)來實現(xiàn)的，機制上來說，主要是抑制NF-κB和MAPK信號通路的過度激活來實現(xiàn)。在AIA小鼠和兔模型中，合成的CSNs在抗炎和骨礦化方面表現(xiàn)出優(yōu)異的生物安全性和治療性能。作者的工作開發(fā)了一種精細的層狀CSNs納米藥物，不僅可以抑制炎癥，而且具備骨修復和軟骨恢復功能，為對抗類風濕性關節(jié)炎提供了基本的理解和可轉化的策略。

使用設備

                                  Micro CT (型號：NEMO) (平生醫(yī)療科技)

                                          影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）