1、試料和初始懸浮液(首次稀釋液)的制備
 
按重量或體積稱取或量取試料,放入滅菌容器或塑料袋中,允許誤差為±5%。一定量的試料(至少10g或10mL,或標(biāo)準(zhǔn)方法另有規(guī)定)應(yīng)能代表用于檢測的實驗室樣品。需指出,使用大于最低要求重量或體積的試料可提高定量檢測結(jié)果的可靠性。
 
加入9倍于試料重量或體積的稀釋液,以制成10倍稀釋樣液。稀釋液最好按質(zhì)量計量,也可按體積計量,允許誤差不得超過±2%。針對某些特定的檢測項目,可酌情降低或增加稀釋液比率,允許誤差亦為±2%。為避免因溫度的驟然變化而損傷目標(biāo)微牛物,除非對特定產(chǎn)品的特殊規(guī)定,所有稀釋液的溫度應(yīng)與實驗室室溫大致相同、按標(biāo)準(zhǔn)要求均質(zhì)樣品和稀釋液的混合物,如有必要,可靜止不超過15min,以讓大顆粒物質(zhì)沉淀,或采用濾過系統(tǒng)去除此類物質(zhì),例如使用帶濾膜的塑料樣品袋。
 
某些種類的產(chǎn)品若按1∶10稀釋制備可能形成較為黏稠或濃厚的懸浮液,影響后續(xù)操作,這些情況下可按1:20、1:50及1:100等稀釋比率添加稀釋液，直至形成適用于后續(xù)試驗的懸浮液。這些非標(biāo)準(zhǔn)化的稀釋比率應(yīng)換算到后續(xù)操作中,尤其是進行計算和結(jié)果表述時。另一些情況下,當(dāng)檢測樣品中較低數(shù)量的微生物,且受試樣品可制成適宜的初懸液時，可能需要制備1:2或1 :5等較低的稀釋比率。然而需注意的是,使用低稀釋比率的初始懸浮液,在后續(xù)轉(zhuǎn)種至液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基時可能造成樣品基質(zhì)與培養(yǎng)基比例的不平衡(如食品組分濃度的相應(yīng)增高會抑制目標(biāo)微生物的生長),因此低稀釋液比率需謹(jǐn)慎使用,并需按具體的案例逐個進行驗證。
 
進行芽孢計數(shù)時,應(yīng)在初始懸浮液制備后立即進行熱處理,如在80℃±5℃,維持10min±1min,然后迅速使用流動冷水浴等冷卻懸浮液,以盡量減少對目標(biāo)微生物芽孢的損耗。
 
2、操作持續(xù)時間
 
從初始懸浮液制備完成到整體接種操作完成,其間不得超過45min。從制備懸浮液到制備后續(xù)稀釋液間不得超過30min。若實驗室環(huán)境溫度偏高,超過了建議范圍(>27℃),則稀釋操作的持續(xù)時間應(yīng)相應(yīng)縮減,盡量避免可能因微生物的增殖導(dǎo)致計數(shù)檢測結(jié)果偏高。
 
某些標(biāo)準(zhǔn)方法中要求稀釋時有一個復(fù)蘇期,以盡量修復(fù)受損傷的微生物,此復(fù)蘇期應(yīng)從初始懸浮液制備完成開始計算,結(jié)束后應(yīng)立即開展后續(xù)稀釋步驟。
 
3、常用稀釋液的相關(guān)要求
 
為提高微生物檢測結(jié)果的再現(xiàn)性,建議使用商品化的即用稀釋液或干粉培養(yǎng)基,并嚴(yán)格按使用說明進行配制和使用。培養(yǎng)基的化學(xué)成分應(yīng)為分析純并適用于微生物檢測﹐配制用水應(yīng)符合要求。各種稀釋液應(yīng)符合再現(xiàn)性要求,標(biāo)準(zhǔn)為添加一定數(shù)量的指定微生物(如大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌),在實驗室環(huán)境溫度(18℃~27℃)下培養(yǎng)45min~1h后,菌落計數(shù)結(jié)果應(yīng)不超過初始計數(shù)結(jié)果的±30%。
 
用于計數(shù)檢測的初始懸浮液,經(jīng)分裝滅菌后的最終液量與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的允許誤差不得超過士2%。為確保達(dá)到此允許誤差,宜將大體積的稀釋液滅菌后再精確地?zé)o菌分裝。
 
ISO 6887-1中規(guī)定的通用稀釋液有以下幾種：
 
①蛋白胨鹽溶液(酶消化酪蛋白1.0g,NaCl 8.5g,水1000mL。在水中溶解各組分,分裝,滅菌,pH7.0±0.2);
 
②緩沖蛋白胨水(蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,Na2HPO4·12H2O 9.0g,KH2PO41.5g，水1000mL。在水中溶解各組分,分裝,滅菌,pH7.0±0.2);
 
③雙料緩沖蛋白胨水,用于高酸性產(chǎn)品(將雙份緩沖蛋白胨水的成分溶解于1000mL水中,分裝,滅菌,pH7.0±0.2)。
 
GB 4789《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗》系列標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的稀釋液為以下兩種：
 
①生理鹽水(稱取8.5g NaCl溶于1000mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min);
 
②磷酸鹽緩沖液(貯存液:稱取34.0g的KH2PO4溶于500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液:取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1000ml,分裝于適宜容器中,121℃高壓滅菌15min)。
 
霉菌和酵母計數(shù)檢驗中規(guī)定除生理鹽水和磷酸緩沖液,也可使用無菌水作為樣品稀釋液。