在生物醫(yī)學(xué)研究的前沿領(lǐng)域，雙光子自發(fā)熒光壽命成像（2P-FLIM）技術(shù)正以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為科學(xué)家們提供了一種全新的視角。這種技術(shù)通過(guò)測(cè)量熒光分子的壽命，而非傳統(tǒng)的熒光強(qiáng)度，為我們揭示了細(xì)胞代謝、分子相互作用以及疾病進(jìn)程中的深層次信息。2P-FLIM技術(shù)的非侵入性、高分辨率和對(duì)復(fù)雜生物環(huán)境的適應(yīng)性，使其在癌癥研究、神經(jīng)科學(xué)、傳染病和傷口愈合等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
細(xì)胞代謝與熒光成像
細(xì)胞代謝是維持生命活動(dòng)的核心過(guò)程，涉及能量產(chǎn)生、物質(zhì)合成和信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)方面。傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)雖然能夠提供細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的可視化信息，但其對(duì)細(xì)胞代謝的動(dòng)態(tài)變化缺乏敏感性。此外，熒光成像中的背景信號(hào)干擾和光漂白現(xiàn)象也限制了其在深層次組織中的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種能夠非侵入性地監(jiān)測(cè)細(xì)胞代謝變化的技術(shù)，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。

熒光壽命成像的優(yōu)勢(shì)
熒光壽命成像技術(shù)通過(guò)測(cè)量熒光分子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的平均時(shí)間（即熒光壽命），提供了一種獨(dú)立于熒光強(qiáng)度的新型成像參數(shù)。熒光壽命不受熒光分子濃度、光漂白和光學(xué)路徑的影響，使其成為研究細(xì)胞內(nèi)化學(xué)環(huán)境變化的理想工具。2P-FLIM技術(shù)通過(guò)雙光子激發(fā)，進(jìn)一步提高了成像的深度穿透能力和空間分辨率，為活體組織的高分辨率成像提供了可能。

技術(shù)挑戰(zhàn)
盡管2P-FLIM技術(shù)具有諸多優(yōu)勢(shì)，但在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，熒光壽命的測(cè)量需要高靈敏度的探測(cè)器和復(fù)雜的信號(hào)處理算法，這增加了設(shè)備的成本和操作難度。其次，生物樣本中的多種熒光分子可能在同一像素內(nèi)共存，導(dǎo)致數(shù)據(jù)解釋的復(fù)雜性。此外，熒光壽命的測(cè)量對(duì)光子計(jì)數(shù)的要求較高，這在自熒光樣本中可能難以實(shí)現(xiàn)。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
雙光子激發(fā)與數(shù)據(jù)處理
2P-FLIM技術(shù)結(jié)合了雙光子激發(fā)和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)（TCSPC），實(shí)現(xiàn)了對(duì)深層組織的高分辨率成像。雙光子激發(fā)通過(guò)同時(shí)吸收兩個(gè)光子使熒光分子激發(fā)，這種激發(fā)方式限制了熒光發(fā)射主要發(fā)生在焦點(diǎn)區(qū)域，從而減少了背景信號(hào)干擾。TCSPC技術(shù)通過(guò)測(cè)量熒光衰減曲線，精確計(jì)算熒光壽命，為研究分子相互作用和代謝變化提供了新的手段。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
代謝變化的可視化
在一系列實(shí)驗(yàn)中，2P-FLIM技術(shù)成功地可視化了細(xì)胞代謝的變化。例如，在對(duì)大腸桿菌感染的3T3細(xì)胞進(jìn)行成像時(shí)，研究人員觀察到NADH的熒光壽命顯著縮短，表明細(xì)胞代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)向糖酵解。這種代謝重編程與細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。此外，在研究沙眼衣原體感染時(shí)，2P-FLIM技術(shù)首次在高分辨率下揭示了病原體與宿主細(xì)胞代謝途徑之間的直接聯(lián)系。

蛋白質(zhì)相互作用的分析
2P-FLIM技術(shù)結(jié)合福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），為研究蛋白質(zhì)相互作用提供了強(qiáng)大的工具。通過(guò)測(cè)量供體熒光壽命的變化，研究人員能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)間的相互作用。例如，在研究神經(jīng)元中Ras蛋白的活性時(shí)，2P-FLIM技術(shù)通過(guò)優(yōu)化的高靈敏度傳感器，成功捕捉到了Ras蛋白在小細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。這種能力為理解信號(hào)傳導(dǎo)途徑在神經(jīng)活動(dòng)中的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。

總結(jié)與展望
雙光子自發(fā)熒光壽命成像（2P-FLIM）技術(shù)以其非侵入性、高分辨率和對(duì)細(xì)胞代謝變化的敏感性，正在改變生物醫(yī)學(xué)研究的格局。從傳染病到神經(jīng)退行性疾病，再到癌癥和傷口愈合，2P-FLIM技術(shù)為科學(xué)家們提供了一個(gè)全新的視角來(lái)探索生命的奧秘。盡管該技術(shù)在設(shè)備成本和操作復(fù)雜性方面仍面臨挑戰(zhàn)，但隨著顯微技術(shù)的不斷進(jìn)步和數(shù)據(jù)分析算法的優(yōu)化，2P-FLIM技術(shù)有望在臨床診斷和治療監(jiān)測(cè)中發(fā)揮更大的作用。2P-FLIM技術(shù)的發(fā)展方向?qū)⒓�中在提高成像速度、增�?qiáng)信號(hào)靈敏度以及與其他成像技術(shù)的融合。此外，將2P-FLIM技術(shù)與其他先進(jìn)的顯微技術(shù)（如受激拉曼散射成像和超分辨顯微鏡）相結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子相互作用的多維度、高分辨率成像。這些創(chuàng)新將為生物醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)新的突破，為疾病的早期診斷、治療效果評(píng)估和機(jī)制研究提供更強(qiáng)大的工具。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Ranawat H, Pal S, Mazumder N. Recent trends in two-photon auto-fluorescence lifetime imaging (2P-FLIM) and its biomedical applications. Biomed Eng Lett. 2019 Jul 1;9(3):293-310. 

DOI:10.1007/s13534-019-00119-7.