基因和siRNA選擇

RNAi實(shí)驗(yàn)的通量可從沉默單個(gè)感興趣的基因，到少量相關(guān)基因或同一個(gè)通路上的基因，到全基因組高通量篩選，取決于需要解決的生物學(xué)問(wèn)題。siRNA的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)染優(yōu)化

用于RNAi實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)有效轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染必須經(jīng)過(guò)優(yōu)化確保siRNA的濃度是最低的有效濃度以避免非特異性效應(yīng)。轉(zhuǎn)染的方法應(yīng)當(dāng)高效、低毒性、便于實(shí)驗(yàn)設(shè)置

表型分析

表型分析通常涉及細(xì)胞學(xué)分析來(lái)檢測(cè)一系列的細(xì)胞參數(shù)，包括存活率、可測(cè)物產(chǎn)量、蛋白定位改變、離子濃度、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、形態(tài)等。

沉默驗(yàn)證

建議使用至少2條siRNA針對(duì)同一mRNA不同的序列。針對(duì)同一基因的2條獨(dú)立siRNA引起同樣的脫靶效應(yīng)的可能性非常低。因此，使用不同的siRNA確認(rèn)表型是一種應(yīng)用起來(lái)簡(jiǎn)單且有說(shuō)服力的方式來(lái)證明所觀察到的表型是特異性基因沉默的結(jié)果。使用多條siRNA來(lái)驗(yàn)證結(jié)果已經(jīng)是發(fā)表RNAi結(jié)果時(shí)許多雜志所必要的條件。基因沉默驗(yàn)證可通過(guò)real-time RT-PCR檢測(cè)mRNA水平或western blotting檢測(cè)蛋白水平。

RT-PCR相關(guān)試劑盒http:///tools/search.asp?kw2=RT-PCR&tn=5