文/韓英
編輯/Bruce.Y
圖片/網(wǎng)絡(luò)+原創(chuàng)

核酸純化在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)廣泛應(yīng)用。怎樣獲得高質(zhì)量、高純度的DNA或RNA樣品對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行至關(guān)重要，因此，對(duì)純化后的核酸進(jìn)行鑒定也是必不可少的步驟。本文簡(jiǎn)單的回顧學(xué)習(xí)一下核酸鑒定的方法。

核酸鑒定包括：濃度/純度鑒定+完整性鑒定

1.濃度/純度鑒定

純凈的DNA OD260/OD280=1.8，制備的樣品DNA比值在1.7-1.9，若洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)镻H值和離子存在會(huì)影響光的吸收值。

當(dāng)OD260/OD280< 1.7，表明蛋白質(zhì)含量較高，可用利用酚、氯仿、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀去除。
當(dāng)OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量較高。可用RNaseA消化后再進(jìn)行純化。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、鹽類或有機(jī)試劑污染。

純凈的RNA OD260/OD280=2.0，制備的樣品DNA比值在1.8-2.1 ，OD260/OD280比值會(huì)受到所用溶液PH值的影響，例如，純化的RNA在PH=7.5的緩沖液中OD260/OD280讀數(shù)在1.9-2.1之間，而在中性的水溶液中比值會(huì)偏低，可能只有1.8-2.0，這并不意味著RNA的質(zhì)量變差，所以還需要做電泳檢測(cè)。

OD260/OD280<1.8時(shí)，溶液中可能存在蛋白或者其他有機(jī)物的污染。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有胍鹽，β-巰基乙醇或乙醇的殘留,但是根據(jù)樣品不同，比值可能有所變化，如下表中小鼠腎和腦組織提取出的RNA260/230比值偏小。

（2）熒光光度法：
熒光光度法以核酸染料溴化乙錠EB嵌入堿基平面后，使本身無(wú)熒光的核酸在紫外線激發(fā)下發(fā)出橙色熒光，且熒光強(qiáng)度積分與核酸含量成正比。該方法靈敏度可達(dá)到1-5ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作為一種新的超靈敏的熒光燃料，可以從瓊脂糖凝膠中檢測(cè)出低于20pg的雙鏈DNA。

用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA大許多，電泳遷移率低；RNA中rRNA最多，占80-85%,tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%-20%，mRNA占1%-5%。RNA電泳后可呈現(xiàn)特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見(jiàn)23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA與tRNA組成的條帶。真核生物為28S 、18S 的rRNA及由5S、 5.8S的rRNA和tRNA組成的條帶。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不到的。通過(guò)電泳分析我們可以鑒定在RNA制品中有無(wú)DNA污染，亦可鑒定在DNA制品中有無(wú)RNA污染。

2.完整性檢測(cè)

常規(guī)使用瓊脂糖凝膠電泳法，基因組DNA的分子量很大，在電場(chǎng)中泳動(dòng)很慢，如果有降解的小分子DNA片段，在電泳圖上可以顯著的表現(xiàn)出來(lái)。

完整的無(wú)降解或者降解很少的RNA電泳圖，除具有特征性的三條帶外，一般28S (或23S)RNA的熒光強(qiáng)度約為18S（或16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解（圖1）。

RNA樣本電泳可能出現(xiàn)明顯的三條以上的條帶（圖2），請(qǐng)不用擔(dān)心，因?yàn)榧?xì)胞中有些細(xì)胞器也含有RNA，如線粒體、葉綠體。如果電泳上樣孔附近有著色條帶，則說(shuō)明有DNA污染。

必要時(shí)，還可以通過(guò)一些特殊的實(shí)驗(yàn)分析RNA的完整性，如小規(guī)模的第一鏈cDNA合成反應(yīng)。

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