植物內(nèi)源基因tRNALeu核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)⊿N標(biāo)準(zhǔn)）

◆ 產(chǎn)品說(shuō)明

 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)系列可針對(duì)食品、飼料等樣品中轉(zhuǎn)基因成分的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于植物內(nèi)源基因的檢測(cè)，檢出限為0.1%。

◆ 產(chǎn)品組成（ 48測(cè)試）

◆ 適用儀器

    熒光PCR儀（ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600）等PCR擴(kuò)增儀。

◆ 自備耗材和儀器

    ①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯(lián)管；③冰盒；④移液器（11-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機(jī)；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴；⑧均質(zhì)機(jī)、攪拌機(jī)或研缽等研磨器具；⑨電子天平。

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)。

   2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求在冰上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測(cè)頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 樣品處理

參照《GB/T 19495.3-2004 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 核酸提取純化方法》或其他標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，制備的樣本保存待用。

詳細(xì)步驟請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作或查閱食安通軟件。

◆ 實(shí)驗(yàn)操作

將試劑完全解凍，各組分離心30s。

1.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）：

若有N個(gè)待檢樣品，則參照下表，按照N+2個(gè)數(shù)量計(jì)算反應(yīng)液用量（N個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對(duì)照+1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照），渦旋混勻，離心30s，分裝于0.2mL PCR管中。

1. 模板制備（樣本制備區(qū)）

   建議使用配套植物基因組DNA提取系列產(chǎn)品，具體過(guò)程詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書。

3．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）

   在步驟1中已含有反應(yīng)液的PCR管中分別加入5μL模板，順序?yàn)镹G-P、待測(cè)樣品模板、PG-tRNALeu-P。

渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

4. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

   使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。

   按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

6.基線和閾值設(shè)定

  基線調(diào)整取3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值線應(yīng)超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)

◆ 結(jié)果判定

檢測(cè)樣品無(wú)Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品陰性，不含有植物成分或含量低于檢測(cè)限；

檢測(cè)樣品Ct≤30，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽(yáng)性，含有植物成分；

檢測(cè)樣品30<Ct≤40，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若Ct值仍處于30和40之間且呈“S”型擴(kuò)增曲線，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)Ct值，報(bào)告樣品陽(yáng)性，否則報(bào)告樣品陰性。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線，此次檢測(cè)結(jié)果有效，否則無(wú)效。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為無(wú)效，請(qǐng)與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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