沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）使用說明書
沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
◆ 產品說明
沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）參照《SN/T 1870—2016 進出口食品中食源性致病菌檢測方法 實時熒光PCR法》進行設計，可針對增食品、飼料等樣品中沙門氏菌的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。該產品檢出限為103 cfu/ml（使用旋達071021M細菌基因組DNA提取試劑盒提取1 ml 103cfu/ml增菌液的細菌基因組DNA作為模板）。
◆ 產品組成（ 12測試）
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011012S |
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試劑 |
含量 |
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A-Sal-P |
250μl |
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PG-Sal-P |
25μl |
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NG |
25μl |
◆ 適用儀器
ABI 7500，CFX 96，Mx 3005P，LineGene9600熒光定量PCR儀。
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯管；③冰盒；④移液器（11-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機；⑥渦旋混勻器；⑦金屬�。虎嗑|機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑨電子天平。
◆ 注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：試劑準備區。
2）第二區：樣本制備區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★ 分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2. 實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗產生的所有廢棄物及時處理。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應液以適當體積分管保存。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆ 樣品處理
參照《GB 4789.4-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》進行沙門氏菌的樣品制備、增菌培養和分離。
◆ 實驗操作
將試劑完全解凍，各組分離心30s。
1. 試劑配制（試劑準備區，放置于冰盒中進行）：
若有N個待檢樣品，則參照下表，按照N+2個數量計算各組分用量（N個待檢樣品+1個陰性對照+1個陽性對照），將反應液置于1.5ml或者2.0ml離心管中，漩渦混勻，離心30秒，分裝于0.2mL PCR管中。
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試劑 |
使用量 |
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A-Sal-P |
20×(N+2)μl |
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反應液總體積 |
20×(N+2)μl |
- 模板制備（樣本制備區）
建議使用試劑配套細菌組DNA提取系列產品，具體過程詳見產品說明書。
3．添加模板（樣本制備區，放置于冰盒中進行）
在步驟1中已含有反應液的PCR管中加入5μl模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-Sal-P。渦旋混勻30s，離心1min，立即進行擴增反應。
4. 擴增反應（擴增及產物分析區）
使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。
按下列條件設置擴增反應：
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PCR循環 |
熒光收集位點 |
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95℃ |
10分鐘 |
1個循環 |
— |
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95℃ |
15秒 |
40個循環 |
— |
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60℃ |
30秒 |
※ |
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6.基線和閾值設定
基線調整取3-15個循環的熒光信號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的最高點
◆ 結果判定
檢測樣品Ct≥40，可報告樣品陰性，不含有沙門氏菌或含量低于檢測限；
檢測樣品Ct＜40，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有沙門氏菌；
- NG反應為平滑直線，PG反應為“S”型擴增曲線且Ct值＜30，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。
