動脈粥樣硬化（atherosclerosis）是心血管系統(tǒng)最常見的疾病之一，對人類健康有嚴重危害。內(nèi)皮細胞炎癥反應作為動脈粥樣硬化的第一步，會導致內(nèi)皮細胞的通透性增加、屏障功能受損以及粘附分子的表達，促使單核細胞遷移并粘附于血管內(nèi)皮表面，進而引發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。

N6-甲基腺嘌呤（m6A）修飾是真核生物中最常見且最豐富的RNA修飾。近期的研究表明，m6A修飾在許多生物學過程中發(fā)揮重要作用，包括發(fā)育、代謝和繁殖。至于m6A在動脈粥樣硬化中發(fā)揮什么作用，目前的研究還很有限，其潛在機制有待闡明。

為此，河南省人民醫(yī)院李牧蔚團隊等機構的研究人員深入研究了m6A修飾在內(nèi)皮細胞炎癥反應中的作用和機制及其對動脈粥樣硬化發(fā)展的影響。他們發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14通過增強m6A修飾而促進FOXO1的表達，進而誘導內(nèi)皮細胞炎癥反應以及動脈粥樣硬化斑塊形成。

這項成果于近日發(fā)表在《Theranostics》雜志上。它首次證明了m6A修飾在內(nèi)皮細胞炎癥和動脈粥樣硬化發(fā)展中的作用，顯示METTL14可作為預防和治療動脈粥樣硬化的潛在靶點。

METTL14修飾了FOXO1的mRNA

在這項研究中，研究人員首先構建了TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞炎癥模型，并評估了m6A修飾相關蛋白的表達變化，以確定參與此過程的主要因素。qRT-PCR和western blot結果顯示，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14在TNF-α誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）中顯著上調(diào)（圖1）。同樣地，METTL14在動脈粥樣斑塊內(nèi)皮細胞中的表達也顯著上調(diào)。

圖1. METTL14在TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞中顯著上調(diào)

接著他們發(fā)現(xiàn)，在TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞中，聚腺苷酸化RNA的m6A/A的比例增加，而METTL14的敲低抑制了這個比例的增加。此外，TNF-α處理和METTL14過表達可提高粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表達水平。有意思的是，METTL14可以獨立于m6A修飾機制來促進VCAM-1和ICAM-1表達。

那么，METTL14通過何種機制來調(diào)控VCAM-1和ICAM-1介導的單核細胞粘附？為了確定背后的機制，研究人員通過甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）來鑒定m6A修飾的mRNA。他們將注意力集中在轉(zhuǎn)錄因子FOXO1上，因為先前的研究表明FOXO1可通過直接結合VCAM-1和ICAM-1的啟動子區(qū)域來促進轉(zhuǎn)錄。

圖2. METTL14修飾FOXO1 mRNA

如圖2所示，TNF-α刺激增加了METTL14與FOXO1 mRNA之間的關聯(lián)，并促進了FOXO1 mRNA的m6A修飾。METTL14的敲低則部分減弱了TNF-α誘導的FOXO1表達。這些結果表明，METTL14介導的FOXO1 m6A修飾促進了內(nèi)皮細胞中FOXO1表達上調(diào)。

YTHDF1通過識別m6A修飾位點來促進FOXO1翻譯

m6A修飾通常通過調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性或促進其翻譯來調(diào)控蛋白表達。研究人員發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激和METTL14敲低對FOXO1 mRNA的穩(wěn)定性沒有明顯影響，故推測調(diào)控作用取決于翻譯。RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，m6A閱讀器蛋白YTHDF1可直接與FOXO1 mRNA結合。

通過多核糖體分離分析，他們證實了TNF-α刺激顯著增強了FOXO1 mRNA的翻譯能力，并且在敲低YTHDF1后，這種作用被顯著抑制。RIP分析結果表明3′-UTR區(qū)域是真正的m6A修飾位點。這一區(qū)域若發(fā)生突變，則TNF-α刺激不會促進m6A修飾，也不會增強YTHDF1的結合。這些結果表明，METTL14直接與FOXO1 mRNA結合并增加其m6A修飾，通過YTHDF1的識別來促進FOXO1翻譯。

METTL14與FOXO1合作促進粘附因子的轉(zhuǎn)錄

盡管METTL14發(fā)揮酶促作用增強m6A修飾，但它是否促進VCAM-1和ICAM-1的轉(zhuǎn)錄呢？研究人員從HUVEC細胞中沉淀了內(nèi)源性METTL14蛋白復合物，并開展質(zhì)譜分析。結果表明，METTL14還與FOXO1形成復合物。通過后續(xù)的細胞學實驗，他們進一步證實，TNF-α處理可誘導FOXO1- METTL14復合物與VCAM-1和ICAM-1啟動子結合，激活這些粘附因子的轉(zhuǎn)錄，從而介導內(nèi)皮細胞炎癥反應。

圖3. METTL14與FOXO1一起促進粘附因子的轉(zhuǎn)錄

METTL14表達的降低明顯抑制動脈粥樣硬化

為了進一步研究METTL14對體內(nèi)動脈粥樣硬化的影響，他們委托賽業(yè)生物構建了雜合的METTL14基因敲除小鼠（因為METTL14基因敲除可導致小鼠在胚胎期死亡）。與對照小鼠相比，METTL14基因敲除顯著降低了動脈粥樣硬化斑塊的形成。體內(nèi)實驗再次證實，METTL14通過調(diào)節(jié)小鼠FOXO1的表達來抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。

這項研究從表觀遺傳學的角度探索了內(nèi)皮細胞炎癥的調(diào)控機制。“我們的結果證實了METTL14可通過對FOXO1的m6A修飾來增強其翻譯，從而增強粘附分子的表達，并介導內(nèi)皮-單核細胞粘附，參與動脈粥樣硬化的發(fā)展。另一方面，METTL14還與FOXO1發(fā)生相互作用，增強FOXO1介導的粘附分子轉(zhuǎn)錄，”作者在文中寫道。

圖4. METTL14介導的m6A修飾影響動脈粥樣硬化的機制

他們指出，這是首次研究m6A修飾在動脈粥樣硬化中的作用。這項研究證明了METTL14在體內(nèi)和體外對內(nèi)皮細胞炎癥和動脈粥樣硬化的作用，有望為動脈粥樣硬化的預防和治療提供新思路。

原文檢索：

Jian D, Wang Y, Jian L, Tang H, Rao L, Chen K, Jia Z, Zhang W, Liu Y, Chen X, Shen X, Gao C, Wang S, Li M. METTL14 aggravates endothelial inflammation and atherosclerosis by increasing FOXO1 N6-methyladeosine modifications. Theranostics 2020; 10(20):8939-8956. doi:10.7150/thno.45178.