甲磺酸乙酯（EMS）細(xì)胞突變誘導(dǎo)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
 
主要用途甲磺酸乙酯（EMS）細(xì)胞突變誘導(dǎo)試劑盒產(chǎn)品說明書
 
甲磺酸乙酯（EMS）細(xì)胞突變誘導(dǎo)試劑是一種旨在使用烷化劑甲磺酸乙酯誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生變異而產(chǎn)生HPRT或TK基因功能缺失的突變株，成為篩選應(yīng)用標(biāo)記細(xì)胞的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于動物細(xì)胞和人體細(xì)胞。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，突變頻率高。
 
技術(shù)背景甲磺酸乙酯（EMS）細(xì)胞突變誘導(dǎo)試劑盒產(chǎn)品說明書
 
甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）是一種化學(xué)誘變致畸的烷化劑（alkylating agent）。它將導(dǎo)致細(xì)胞次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase；HPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase，TK）基因座發(fā)生位點突變，而引起基因功能缺失。由此采用6-硫氫基鳥糞嘌呤（6-thioguanine；6-TG）和5-溴脫氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine；BudR）分別篩選TK和HPRT缺失型細(xì)胞，因為6-TG是PURINES的結(jié)構(gòu)替代物，而BUdR是THYMIDINE的結(jié)構(gòu)類似物，當(dāng)TK和HPRT正常的情況下，它們將利用6-TG和BUdR進(jìn)行DNA復(fù)制而使細(xì)胞死亡，反之，它們無法利用，細(xì)胞則繼續(xù)生存。這是負(fù)向選擇。但是HPRT正常的細(xì)胞（例如正常人體細(xì)胞，其X染色體的長臂上帶有此基因）能在氨基嘌呤胸苷（hypoxanthine/aminopterin/thymidine；HAT）培養(yǎng)基中生長，這是正向選擇。
 
產(chǎn)品內(nèi)容甲磺酸乙酯（EMS）細(xì)胞突變誘導(dǎo)試劑盒產(chǎn)品說明書
 
 EMS 溶液A（Reagent A）         5毫升
 EMS 溶液B（Reagent B）     5毫升
 EMS 溶液C（Reagent C）     5毫升
 EMS 溶液D（Reagent D）     5毫升
 EMS 溶液E（Reagent E）     5毫升
清理液（Reagent F）      2 X 500毫升
染色液（Reagent G）        200毫升
 TK篩選液（Reagent H）    12毫升
產(chǎn)品說明書              1份
 
保存方式
 
 TK篩選液（Reagent H）保存在－20℃冰箱里；清理液（Reagent F）和 EMS溶液保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent G）保存在室溫下； EMS溶液具有毒性，注意操作安全。有效保證6月
 
用戶自備
 
25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶：用于培養(yǎng)細(xì)胞的容器
75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶：用于培養(yǎng)細(xì)胞的容器
 DMEM完全細(xì)胞培養(yǎng)基（12052）：用于細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)基
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離
血細(xì)胞計數(shù)器：用于細(xì)胞計量
封口膜：用于密封培養(yǎng)瓶后長期保存
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
臺式離心機(jī)：用于樣品離心操作
 1摩爾硫代硫酸鈉（12043）：用于EMS解毒
 
實驗步驟
 
一．確定甲磺酸乙酯（EMS）的毒力曲線
 

• 準(zhǔn)備5瓶25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并標(biāo)記為1至5號試驗瓶
• 接種用戶需化學(xué)誘變的細(xì)胞
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，直到細(xì)胞生長密度達(dá)50％
• 抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 分別加入5毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 依次加入50微升 EMS溶液A至E（Reagent A至E）到相對應(yīng)的培養(yǎng)瓶1至5號（ EMS溶液A即1號為對照組）
• 輕輕搖勻后，放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24小時
• 抽去培養(yǎng)液，分別加入5毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液（不含 EMS溶液）
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24小時
• 抽去培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液
• 分別加入3毫升清理液（Reagent F），清洗生長中的細(xì)胞表面
• 分別抽掉3毫升清洗液
• 分別加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱孵育2分種
• 輕輕抖動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入5毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 分別移入15毫升錐形離心管
• 在血細(xì)胞計數(shù)器上計數(shù)
• 分別移取總量為1000個細(xì)胞到5個新的25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并作好對應(yīng)標(biāo)記
• 加入用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液至總量為5毫升
• 放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，直至肉眼清晰可見細(xì)胞群落（1周左右）
• 小心抽去培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液
• 輕輕分別加入3毫升清理液（Reagent F）到每個培養(yǎng)瓶里，清洗生長表面
• 小心抽去每個培養(yǎng)瓶里的清理液
• 分別加入2毫升的染色液（Reagent G）到每個培養(yǎng)瓶里，覆蓋生長表面
• 在室溫下靜置20分鐘
• 抽去染色液（Reagent G）
• 分別加入3毫升清理液（Reagent F），清洗細(xì)胞表面
• 分別抽掉清理液（Reagent F）
• 肉眼觀察并計數(shù)細(xì)胞群落
• 繪制細(xì)胞群落數(shù)和EMS濃度曲線
• 確定細(xì)胞群落數(shù)是對照組（1號培養(yǎng)瓶）的30％為最佳EMS誘導(dǎo)濃度
• 用封口膜密封培養(yǎng)瓶，可在室溫下長時間保存

 
二．實施甲磺酸乙酯（EMS）的細(xì)胞誘變
 

• 準(zhǔn)備1瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶
• 接種用戶需化學(xué)誘變的細(xì)胞
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，直到細(xì)胞生長密度達(dá)50％
• 抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入20毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入200微升誘導(dǎo)濃度的 EMS溶液（實驗一確定的A至E中的一種）到培養(yǎng)瓶（1：100）
• 輕輕搖勻后，放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24小時
• 抽去培養(yǎng)液
• 分別加入20毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液（不含 EMS溶液）
• 放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24小時
• 抽去培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液
• 加入5毫升清理液（Reagent F），清洗生長中的細(xì)胞表面
• 抽去5毫升清理液（Reagent F）
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱孵育3分種
• 輕輕抖動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入6毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入9毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻
• 平均移取3毫升到3瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶
• 每瓶分別加入17毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液到培養(yǎng)瓶里，總量為20毫升
• 每瓶分別加入200微升 TK篩選液（Reagent H），輕輕混勻
• 放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育2至3周
• 獲得突變細(xì)胞株（TK^-）