一般情況下，實時熒光定量PCR引物設(shè)計原則中會提到擴(kuò)增子大小對實時熒光定量PCR的擴(kuò)增效率有一定作用。所以通常建議使用相對較短的擴(kuò)增子長度，范圍為50到150個堿基對（bp）。由于小片段不太容易在傳統(tǒng)PCR中所用的瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)，因此這種小片段擴(kuò)增在傳統(tǒng)PCR中檢測更為困難。qPCR的出現(xiàn)使得擴(kuò)增小于100bp的基因片段成為可能。本文將為大家介紹擴(kuò)增子大小對qPCR產(chǎn)量的影響，表明使用小片段檢測的優(yōu)勢所在。

將大豆的RR和Lectin基因作為研究對象，各基因的正向引物被保留，反向引物以+/-40bp的步進(jìn)移動以增加擴(kuò)增子的大小。將正向引物保持在探針附近，以使探針在延伸步驟中被Taq聚合酶的核酸外切酶活性快速水解。RR擴(kuò)增子大小分別為83、121、160、198、248、319和362bp。Lectin擴(kuò)增子大小分別為：81、109、158、197、228、288、342和363 bp（圖1）。

▲圖1：所用引物和探針的位置

采用TaqMan探針法和SYBR Green染料法對不同的樣本進(jìn)行qPCR檢測，結(jié)果表明擴(kuò)增子的大小可直接影響檢測結(jié)果：隨著擴(kuò)增子長度的增加，Cq值整體呈現(xiàn)增加的趨勢（表1和表2）。在SYBR Green檢測結(jié)果中，擴(kuò)增子長度的增加對Cq值的影響不太明顯，但在TaqMan檢測結(jié)果中，可以發(fā)現(xiàn)83bp和362bp擴(kuò)增子對應(yīng)的Cq值可最大相差15.63。

▲表1：使用TaqMan法對不同長度擴(kuò)增子的qPCR檢測

▲表2：使用探針法和染料法對不同長度擴(kuò)增子的qPCR檢測

如圖2所示，是使用不同的引物獲得的擴(kuò)增曲線線性圖譜，對于較短的擴(kuò)增子，可以被更早地檢測到熒光信號（較低的Cq值）以及具有更高的熒光強(qiáng)度（較高的平臺期）。對于較長的擴(kuò)增子，其擴(kuò)增效率一定程度上降低。83bp和121bp擴(kuò)增子的擴(kuò)增效率約為100%，隨著擴(kuò)增子長度的增加，擴(kuò)增效率呈下降趨勢，362bp擴(kuò)增子的擴(kuò)增效率最低可以達(dá)到50%。

▲圖2：不同長度擴(kuò)增子的擴(kuò)增曲線

注：橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度

綜上所述，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增曲線的動力學(xué)效應(yīng)隨擴(kuò)增子大小的變化而變化，擴(kuò)增子越小，平臺期的熒光強(qiáng)度越高。尤其是在TaqMan檢測中，更要注意擴(kuò)增子大小的設(shè)計，為了獲得較高的擴(kuò)增效率以及較低的Cq值，其擴(kuò)增子長度應(yīng)控制在50-150bp之間。

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參考文獻(xiàn)：

The influence of amplicon length on real-time PCR results. 2017.