中性粒細胞(圖1A)是人類最豐富的白細胞，是先天免疫系統的重要組成部分，占人類所有白細胞的40%至70%。中性粒細胞由骨髓中的干細胞形成(圖1B)，并分化成嗜中性粒細胞和嗜中性粒細胞鈣化細胞亞群。中性粒細胞是一種吞噬細胞，同時也是急性炎癥的標志，具有趨化、吞噬和殺菌作用。另外，中性粒細胞也可通過直接殺死腫瘤細胞和參與介導抗腫瘤抵抗的細胞網絡來介導抗腫瘤反應，調節腫瘤免疫微環境。因此，中性粒細胞有望成為未來腫瘤等疾病治療的重要靶標。
在單細胞分辨率下的研究中，中性粒細胞不容易被檢測到，具體原因有以下兩點：①中性粒細胞脆弱、壽命短，在人體內半衰期為7-10小時，對處理過程要求的技術水平相對較高；②中性粒細胞中表達的mRNA分子量低。所以，針對中性粒細胞的單細胞測序有一些挑戰。
 為了高分辨率地剖析非小細胞癌(NSCLC)腫瘤微環境，Salcher等在文章“High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer”中整合了來自19個研究中的505個單細胞NSCLC腫瘤和健康人源樣本，并注釋出12種細胞類型(圖2A)。對比不同測序平臺細胞亞群的組成分析結果，新格元GEXSCOPE®單細胞測序平臺(以下簡稱GEXSCOPE)采取微流控微孔法分離和捕獲細胞，更加溫和，可以檢測出符合預期的中性粒細胞。
  包括T細胞，NK細胞，傳統樹突狀細胞，基質細胞，上皮細胞，B細胞，血漿樹突細胞，效應B細胞，肥大細胞，中性粒細胞，內皮細胞和巨噬細胞
 
案例一、解析晚期NSCLC的腫瘤微環境內中性粒細胞特征
在文章“Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer”中，作者分析了42例III/IV期NSCLC患者的穿刺樣本，將肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、驅動基因突變與野生型等多種類型的腫瘤組織進行比較，呈現了晚期NSCLC的大規模、單細胞分辨率的腫瘤組織微環境圖譜，并對腫瘤組織進行異質性分析。其中，捕獲到中性粒細胞的樣本所占比例為0.05%-50.62%，具有高度的異質性。在17種樣品中，所占比例不到5%，說明GEXSCOPE對中性粒細胞的捕捉非常敏感，即使比例較低，也能檢測到。
在本研究中，作者對LUAD病人進行了細胞成分及腫瘤亞型相關分析，發現LUAD病人的中性粒細胞數量明顯下降，并且中性粒細胞在腫瘤中的浸潤程度與ITHGEX評分成正比。此前，其他NSCLC研究證實，腫瘤微環境的差異會導致LUSC患者的中性粒細胞比LUAD更多，并且腫瘤組織中高活性粒細胞數量和腫瘤內高度異質性是導致腫瘤免疫療效差的重要原因。文章進一步彌合了高嗜中性粒細胞含量和高腫瘤異質性之間的相關性，從一個全新的角度來探討NSCLC中中性粒細胞的生物學特性，并為中性粒細胞在NSCLC及免疫治療中的潛在功能研究提供理論依據[2]。
案例二、通過GEXSCOPE揭示STZ誘導的1型糖尿病小鼠中性粒細胞與骨髓與骨質減少關系緊密
1型糖尿病(T1D)是一種多因素自身免疫性疾病。盡管T1D患者出現骨量下降及骨組織破壞等一系列臨床癥狀，但T1D致骨量下降的分子機理尚不清楚，猜測與骨髓中的炎癥反應相關。在文章“Single-cell RNA sequencing analysis reveals the relationship of bone marrow and osteopenia in STZ-induced type 1 diabetic mice”中，作者建立了鏈脲佐菌素(STZ)誘發的T1D小鼠模型(D)，并以健康小鼠(C)為對照，對兩組小鼠股骨和脛骨的全骨髓細胞進行單細胞測序。研究結果顯示，兩組小鼠的細胞占比存在顯著的不同，D組小鼠中BM-中性粒細胞比例顯著增加。
進一步研究顯示，中性粒細胞cluster1在糖尿病患者血清中顯著富集于成骨細胞分化、IL-17信號通路和TNF信號通路。這個結果也與健康和STZ誘導的T1D小鼠之間上調的DEGs的KEGG分析相一致。這些結果表明，中性粒細胞cluster1可能密切涉及T1D和T1D誘發的骨質疏松的病理過程，提示中性粒細胞與糖尿病患者的骨量下降關系緊密。研究者們利用D組和C組的細胞比例信息分析了組間差異，發現中性粒/B細胞比率與T1D模型的骨量呈正相關。據此，文章提出了外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)升高是由骨髓NLR升高引起的假說[3]。
     
案例三、通過GEXSCOPE研究排卵前卵泡微環境的內在異質性
卵泡微環境，包括卵泡內顆粒細胞(GCs)，負責卵母細胞成熟和隨后的排卵。然而，卵泡微環境中的GCs和細胞成分在排卵前卵泡中的功能尚未被廣泛探討。文章“Single-Cell Sequencing Reveals an Intrinsic Heterogeneity of the Preovulatory Follicular Microenvironment”在單細胞分辨率下調查了體外受精中六個人類排卵前卵泡中MII卵母細胞周圍卵泡微環境。如圖5-1/2所示，作者展示了來自所有樣本的14,592個高質量細胞的UMAP圖和六種細胞類型中特征基因的表達模式，包括顆粒細胞(GCs)、巨噬細胞、樹突狀細胞(dc)、T細胞、上皮細胞和中性粒細胞。通過研究巨噬細胞、dc、T細胞和中性粒細胞之間趨化因子的相互作用(圖5-3)，文章發現了巨噬細胞的浸潤和富集在GC功能的調節和DCs、T細胞和中性粒細胞的募集中起著關鍵作用。最終，文章鑒定了排卵前卵泡中顆粒細胞以及其他細胞類型的不同功能簇，揭示了排卵過程中GC中特定基因的動態，并揭示了主要細胞類型(包括各種免疫細胞類型)之間潛在的細胞相互作用[4]。
 
此外，GEXSCOPE在多個研究中都輔助解析了免疫細胞景觀：Zhang等通過對慢性乙肝肝衰竭患者(CLF)、1個日本血吸蟲合并乙肝患者(SJ)及2個健康人(HC)肝組織中的肝臟非實質細胞(NPCs)進行了高通量單細胞測序，鑒定肝內浸潤的免疫細胞類型和狀態，以探索血吸蟲病肝組織中發生肝纖維化的免疫機制，揭示了疾病組與對照組之間免疫微環境的異質性，其中也包括中性粒細胞的異質性[5]。Kong等通過對腎移植后慢性抗體介導排斥反應(cABMR)發生和發展過程中免疫細胞的單細胞轉錄組測序，揭示了cABMR中強烈的T/B細胞和中性粒細胞激活，闡明了cABMR的免疫全景和致病性免疫應答以及cABMR臨床治療的潛在治療策略的意義[6]。
作為一家擁有一站式單細胞解決方案的公司，新格元擁有獨立開發單細胞測序系統的研發、產品和服務團隊。在對多種組織樣本中的中性粒細胞的采集、分析、標注等方面有著豐富的項目經驗積累，能夠在單細胞水平上發現單個細胞所特有的細微改變，發現新的細胞種類，并進行腫瘤異質性的鑒別，為深入理解生命活動與疾病發生發展提供新的思路。單細胞轉錄組測序分析可能為中性粒細胞相關的研究提供另一個全面的視角，從細胞學水平上揭示中性粒細胞在多種疾病發生發展過程中的功能，并為臨床靶向治療、數據挖掘等研究奠定細胞分子生物學基礎。

參考文獻
[1]Salcher S, Sturm G, Horvath L, et al. High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 2022 Dec 12;40(12):1503-1520.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2022.10.008. Epub 2022 Nov 10. PMID: 36368318; PMCID: PMC9767679.
[2]Wu F, Fan J, He Y, Xiong A, Yu J, et al. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer. Nat Commun. 2021 May 5;12(1):2540. doi: 10.1038/s41467-021-22801-0. PMID: 33953163; PMCID: PMC810017
[3]Zhong J, Mao X, Li H, Shen G, et al. Single-cell RNA sequencing analysis reveals the relationship of bone marrow and osteopenia in STZ-induced type 1 diabetic mice. J Adv Res. 2022 Nov;41:145-158. doi: 10.1016/j.jare.2022.01.006. Epub 2022 Jan 21. PMID: 36328744; PMCID: PMC9637485.
[4]Wu H, Zhu R, Zheng B, et al. Single-Cell Sequencing Reveals an Intrinsic Heterogeneity of the Preovulatory Follicular Microenvironment. Biomolecules. 2022 Jan 29;12(2):231. doi: 10.3390/biom12020231. PMID: 35204732; PMCID: PMC8961562.
[5]Zhang Y, Li J, Li H, et al. A preliminary investigation into the immune cell landscape of schistosome-associated liver fibrosis in humans. Immunol Cell Biol. 2021 Sep;99(8):803-813. doi: 10.1111/imcb.12490. Epub 2021 Aug 6. PMID: 34355810; PMCID: PMC8456952.
[6]Kong F, Ye S, Zhong Z, Zhou X, et al. Single-Cell Transcriptome Analysis of Chronic Antibody-Mediated Rejection After Renal Transplantation. Front Immunol. 2022 Jan 17;12:767618. doi: 10.3389/fimmu.2021.767618. PMID: 35111153; PMCID: PMC8801944.