熒光Western Blot的磷酸化蛋白檢測優勢及相關實驗流程
什么是蛋白磷酸化？
蛋白磷酸化是生物體內廣泛存在的蛋白翻譯后修飾方式，與蛋白質活力和功能的調控密切相關，是細胞骨架調控、神經活動、肌肉收縮、新陳代謝及腫瘤發生等領域重要的研究內容。
化學發光Western Blot的局限
Western Blot是評估蛋白磷酸化狀態的最常用方法。然而，由于磷酸化與非磷酸化蛋白的分子量差異極小，若使用傳統的化學發光方法進行檢測，需先使用磷酸化蛋白抗體進行孵育，成像檢測后進行剝離，重孵育非磷酸化蛋白抗體。剝離及重孵育步驟不僅耗費更多的時間和試劑，更對蛋白定量產生消極影響（剝離過程可能損失一部分目的蛋白或剝離不完全）。
熒光Western Blot讓磷酸化蛋白檢測更快更準
熒光Western Blot克服了傳統化學發光法的局限，通過使用不同熒光基團（光譜無重疊）標記不同的二抗，可進行不同蛋白的多重檢測，無需剝離。基于熒光Western Blot的磷酸化蛋白檢測有兩大優勢：
精簡實驗，快速高效
下表1顯示了化學發光與熒光Western Blot檢測流程及耗時對比（詳見文末相關實驗流程）。由表可見，轉印后到上機檢測前，傳統的化學發光法約需6.5h，而采用熒光法不到3h即可完成，實驗耗時縮減了近60%，精簡流程，告別低效能！
無需剝離，精準定量
熒光Western Blot由于其多重檢測特性，無需剝離和重孵育，即可同時檢測磷酸化和非磷酸化蛋白。避免化學發光法剝離過程中造成的蛋白損失或剝離不完全，從而保障蛋白定量的準確性。下圖左、右分別為使用化學發光及熒光Western Blot的成像效果，樣品圖像為Azure C系列多功能分子成像系統拍攝。
NIR近紅外熒光檢測法，因其印跡膜自發熒光更低、靈敏度更高、信噪比更好，是首選的熒光檢測方法。基于成熟的NIR 近紅外熒光應用技術，Azure Biosystems繼Azure C系列多功能分子成像系統后，升級推出Azure多功能分子成像系統及Sapphire FL激光掃描成像系統，自上市以來備受用戶青睞，賦能更卓越實驗室成像體驗！
— 相關實驗流程 —
未處理組和使用IFNα 處理組的Hela 細胞裂解液進行SDS 聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離。使用Azure Transfer Buffer 將蛋白樣品轉印到PVDF 膜上。將膜剪開，一半用化學發光檢測，一半用熒光檢測，具體操作如下文所述。
化學發光檢測實驗流程
轉印后，印跡膜用磷酸化-STAT1 抗體進行檢測。
1. 印跡膜封閉30min，隨后使用4μg 兔抗- 磷酸化-STAT1 抗體孵育1h，使用25mL的Azure Fluorescent Wash Buffer 浸潤2次后，再洗膜3次，每次5min。
2. 使用3μg HRP 標記anti- 兔抗體孵育膜1h后， 按照上述方法洗膜，置于10mL化學發光底物孵育2min后， 使用Azure C 系列多功能分子成像系統采集圖像。
3. 印跡膜剝離：1. 印跡膜在高純水中浸潤5min；2. 印跡膜置于Azure HRP Stripping Buffer中5min。
4. 剝離后，使用25mL的Azure Fluorescent Wash Buffer漂洗印跡膜，2次快速漂洗后，進行3次（每次5min）漂洗。
5. 印跡膜再次進行30min 封閉， 使用4μg 鼠抗STAT1 抗體孵育1h，使用25mL Azure Fluorescent Wash Buffer 漂洗3 次，每次5min。使用3μg HRP 標記的anti- 鼠抗體孵育1h，然后按照上述方法洗膜，置于10mL化學發光底物中孵育2min后，使用Azure C系列多功能分子成像系統中采集圖像。
NIR 近紅外熒光檢測實驗流程
轉印后，印跡膜室溫封閉10min，使用4μg 兔抗- 磷酸化-STAT1 抗體和4μg鼠抗-STAT1 抗體孵育1h， 使用25mL Azure Fluorescent Wash Buffer 漂洗3次，每次5min。隨后使用4μg NIR-800 標記的anti- 兔抗體和4μg NIR700 標記的anti- 鼠抗體孵育1h，按上述漂洗方法漂洗后，使用25ml 的PBS 浸潤5min，使用Azure C 系列多功能分子成像系統IR800（綠色）和IR700（紅色）通道采集圖像。
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Azure Biosystems成立于2013年，總部位于美國加州灣區，是一家致力于生命科學領域先進生物成像系統研發、制造、推廣及服務一體的創新型公司。擁有分子成像領域近30年經驗的卓越團隊，Azure公司革新推出的Azure系列新一代多功能分子成像系統和Sapphire激光掃描成像系統已成為技術領先的特色產品。目前，公司已形成分子凝膠成像、Western Blot、RT-PCR及配套試劑耗材等產品線。
公司成像設備全球裝機＞5000臺，用戶數量＞30000，包括美國最高科研機構NIH、梅約診所、哈佛大學、中國科學院、清華大學、諾華制藥等知名科研院所、醫院及生物醫藥企業等。截至目前，發表文章＞3000篇，發表刊物包括Cell、Science、Nature三大期刊及子刊、JBC、JMC等國際著名期刊雜志。
