靶基因甲基化測(cè)序(Target-BS)等在揭示特應(yīng)性皮炎新發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見的炎癥性皮膚疾病，特征為劇烈瘙癢、復(fù)發(fā)性濕疹樣病變和Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cell，Treg）在調(diào)控炎癥、抑制Th2細(xì)胞(T helper 2 cell)和維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。先前的研究對(duì)于AD患者中Treg比例存在沖突結(jié)果，一些研究發(fā)現(xiàn)Treg比例未改變，而其他研究則報(bào)告Treg數(shù)量增加。在過(guò)敏性疾病中，Treg對(duì)Th2細(xì)胞的抑制作用被破壞以及Th2型炎癥的促進(jìn)背后的精確分子機(jī)制尚不清楚。因此，探究AD中Treg數(shù)量和功能變化背后的分子機(jī)制至關(guān)重要。
近日，南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院梁云生課題組探討了在特應(yīng)性皮炎（AD）中，Treg數(shù)量和功能變化的分子機(jī)制，以及這些變化如何影響Th2型炎癥。相關(guān)研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”為題發(fā)表在《Journal of Dermatological Science》期刊。
研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、mRNA測(cè)序（mRNA-seq）、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、共免疫沉淀、染色質(zhì)免疫沉淀和亞硫酸鹽測(cè)序（BS-seq）等方法，在體外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子機(jī)制。分析結(jié)果表明在輕度和中度AD中檢測(cè)到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)特征性減少則與血清IL-4 (interleukin-4)水平相關(guān)，這與體外高濃度IL-4處理下的驗(yàn)證分析結(jié)果一致。其背后機(jī)制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來(lái)抑制Foxp3和CTLA-4位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。高水平的IL-4破壞了Treg通過(guò)CTLA-4介導(dǎo)的Th2細(xì)胞分化抑制，而在Treg中阻斷IL-4Rα信號(hào)恢復(fù)了AD模型小鼠和AD患者的Treg數(shù)量和Th2細(xì)胞抑制。
總之，本研究結(jié)果表明，Treg數(shù)量及AD患者嚴(yán)重程度分級(jí)與血清IL-4水平相關(guān)。異常高水平IL-4表觀遺傳調(diào)控Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)減少。IL-4誘導(dǎo)Treg上的CTLA-4表達(dá)減少損害了Th2細(xì)胞分化抑制。
研究方法
結(jié)果圖形
（1）Treg數(shù)量與AD嚴(yán)重程度分級(jí)和血清中IL-4水平相關(guān)。IL-4導(dǎo)致重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)減少。
B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年齡性別匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表達(dá)（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中篩選）的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表達(dá)與血清IL-4水平之間的相關(guān)性。
E. 培養(yǎng)的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T細(xì)胞中篩選）、CTLA-4+表達(dá)（在CD4+ T細(xì)胞中篩選）的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信號(hào)通路如何通過(guò)招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）和組蛋白去乙�；�2（HDAC2）來(lái)抑制Foxp3和CTLA-4基因位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
圖2. IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來(lái)抑制Foxp3和CTLA-4位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。從健康志愿者（HV）的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中純化出初始T細(xì)胞，并在體外用IL-2/TGFβ1培養(yǎng)4天，然后有或沒(méi)有高濃度IL-4刺激額外3天。
A. 聚類熱圖顯示培養(yǎng)的Treg中轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)，其中深紅色表示高基因表達(dá)水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位點(diǎn)的CpG DNA甲基化，以分析IL-4處理/未處理組Treg的甲基化狀態(tài)。圖表顯示通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序鑒定的DNA甲基化數(shù)量。
D. 收集Treg細(xì)胞、裂解，并用抗pSTAT6抗體免疫沉淀（IP）。通過(guò)免疫印跡法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗體。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Foxp3啟動(dòng)子和CNS2的免疫沉淀DNA的相對(duì)量，并相對(duì)于IgG進(jìn)行歸一化。
F. Treg被轉(zhuǎn)染HDAC2 siRNA或?qū)φ誷iRNA，并在體外用IL-2/TGFβ1培養(yǎng)4天，然后有或沒(méi)有高濃度IL-4刺激額外3天。代表性的流式細(xì)胞術(shù)和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表達(dá)。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Foxp3和CTLA-4啟動(dòng)子的免疫沉淀DNA的相對(duì)量，并相對(duì)于IgG進(jìn)行歸一化。每組n=3，三個(gè)重復(fù)。
（3）高水平IL-4破壞了CTLA-4介導(dǎo)的Treg對(duì)Th2細(xì)胞分化的抑制作用。
B. Teffs中IL-4表達(dá)的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。每組n=3，三個(gè)重復(fù)。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破壞了Treg對(duì)Th2型炎癥的抑制作用。
B-C. 第16天從整個(gè)耳朵和血液中IL-4+表達(dá)的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
D-E. 第16天從整個(gè)耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表達(dá)的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。每組n=3只小鼠，三個(gè)重復(fù)。
（5）達(dá)必妥(Dupilumab) 恢復(fù)了重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)，并抑制Th2型炎癥。
圖5. Dupilumab恢復(fù)了重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)及其對(duì)Th2炎癥的抑制作用。
A. 在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)AD患者外周血中Foxp3+ CD25+ Treg的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
C. 在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Th2細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
易小結(jié)
參考文獻(xiàn)：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
近日，南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院梁云生課題組探討了在特應(yīng)性皮炎（AD）中，Treg數(shù)量和功能變化的分子機(jī)制，以及這些變化如何影響Th2型炎癥。相關(guān)研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”為題發(fā)表在《Journal of Dermatological Science》期刊。
研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、mRNA測(cè)序（mRNA-seq）、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、共免疫沉淀、染色質(zhì)免疫沉淀和亞硫酸鹽測(cè)序（BS-seq）等方法，在體外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子機(jī)制。分析結(jié)果表明在輕度和中度AD中檢測(cè)到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)特征性減少則與血清IL-4 (interleukin-4)水平相關(guān)，這與體外高濃度IL-4處理下的驗(yàn)證分析結(jié)果一致。其背后機(jī)制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2來(lái)抑制Foxp3和CTLA-4位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。高水平的IL-4破壞了Treg通過(guò)CTLA-4介導(dǎo)的Th2細(xì)胞分化抑制，而在Treg中阻斷IL-4Rα信號(hào)恢復(fù)了AD模型小鼠和AD患者的Treg數(shù)量和Th2細(xì)胞抑制。
總之，本研究結(jié)果表明，Treg數(shù)量及AD患者嚴(yán)重程度分級(jí)與血清IL-4水平相關(guān)。異常高水平IL-4表觀遺傳調(diào)控Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)減少。IL-4誘導(dǎo)Treg上的CTLA-4表達(dá)減少損害了Th2細(xì)胞分化抑制。
研究方法
- 研究隊(duì)列：42名AD患者和14名健康志愿者（(healthy volunteers，HVs），以及用于實(shí)驗(yàn)的特定基因敲除小鼠。
- 通過(guò)MC903誘導(dǎo)AD小鼠模型，評(píng)估耳厚度和組織學(xué)變化。
- 從人和小鼠樣本中分離和分化細(xì)胞，進(jìn)行Treg抑制實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析。
- 使用ELISA和Western blotting技術(shù)分析血清和蛋白表達(dá)水平。
- 通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序（Target-BS）和共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)分析DNA甲基化和蛋白相互作用。
- 進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和RT-qPCR分析特定基因位點(diǎn)的表觀遺傳修飾。
結(jié)果圖形
（1）Treg數(shù)量與AD嚴(yán)重程度分級(jí)和血清中IL-4水平相關(guān)。IL-4導(dǎo)致重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)減少。
圖1. IL-4水平增加導(dǎo)致重度AD患者中Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)減少。
A. AD患者和健康志愿者（HVs）中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD3+ CD4+ T細(xì)胞中篩選）的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年齡性別匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表達(dá)（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中篩選）的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表達(dá)與血清IL-4水平之間的相關(guān)性。
E. 培養(yǎng)的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T細(xì)胞中篩選）、CTLA-4+表達(dá)（在CD4+ T細(xì)胞中篩選）的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信號(hào)通路如何通過(guò)招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）和組蛋白去乙�；�2（HDAC2）來(lái)抑制Foxp3和CTLA-4基因位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
A. 聚類熱圖顯示培養(yǎng)的Treg中轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)，其中深紅色表示高基因表達(dá)水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位點(diǎn)的CpG DNA甲基化，以分析IL-4處理/未處理組Treg的甲基化狀態(tài)。圖表顯示通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序鑒定的DNA甲基化數(shù)量。
D. 收集Treg細(xì)胞、裂解，并用抗pSTAT6抗體免疫沉淀（IP）。通過(guò)免疫印跡法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗體。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Foxp3啟動(dòng)子和CNS2的免疫沉淀DNA的相對(duì)量，并相對(duì)于IgG進(jìn)行歸一化。
F. Treg被轉(zhuǎn)染HDAC2 siRNA或?qū)φ誷iRNA，并在體外用IL-2/TGFβ1培養(yǎng)4天，然后有或沒(méi)有高濃度IL-4刺激額外3天。代表性的流式細(xì)胞術(shù)和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表達(dá)。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Foxp3和CTLA-4啟動(dòng)子的免疫沉淀DNA的相對(duì)量，并相對(duì)于IgG進(jìn)行歸一化。每組n=3，三個(gè)重復(fù)。
（3）高水平IL-4破壞了CTLA-4介導(dǎo)的Treg對(duì)Th2細(xì)胞分化的抑制作用。
圖3. 高水平IL-4破壞了CTLA-4介導(dǎo)的Treg對(duì)Th2細(xì)胞分化的抑制作用，OTII小鼠脾臟中分離的CTV標(biāo)記的CD4+ CD25− Teffs和從BMDCs衍生的DCs與Foxp3YFP/Cre或Il4rafl/fl Tregs以1:1:1的比例共培養(yǎng)2天。
A. CTV標(biāo)記的Teffs數(shù)量和定量。B. Teffs中IL-4表達(dá)的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。每組n=3，三個(gè)重復(fù)。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破壞了Treg對(duì)Th2型炎癥的抑制作用。
圖4. IL-4破壞了AD小鼠模型中Treg對(duì)Th2型炎癥的抑制作用。
A. 第16天用乙醇（EtOH）或MC903處理的小鼠耳朵的代表性圖像和組織學(xué)H&E染色結(jié)果。B-C. 第16天從整個(gè)耳朵和血液中IL-4+表達(dá)的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
D-E. 第16天從整個(gè)耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表達(dá)的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。每組n=3只小鼠，三個(gè)重復(fù)。
（5）達(dá)必妥(Dupilumab) 恢復(fù)了重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)，并抑制Th2型炎癥。
圖5. Dupilumab恢復(fù)了重度AD患者的Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)及其對(duì)Th2炎癥的抑制作用。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
C. 在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)Th2細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞術(shù)和定量分析。
易小結(jié)
- Treg數(shù)量和AD的嚴(yán)重程度分級(jí)與血清IL-4水平相關(guān)。
- 異常高水平的IL-4表觀遺傳調(diào)控Treg數(shù)量和CTLA-4表達(dá)減少。
- Treg中由IL-4誘導(dǎo)的CTLA-4表達(dá)減少破壞了Th2細(xì)胞分化抑制。
- 阻斷Treg中的IL-4Rα信號(hào)可以恢復(fù)Treg數(shù)量和對(duì)Th2型炎癥的抑制，為AD治療提供了新的策略和深入的機(jī)制理論。
參考文獻(xiàn)：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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