細胞復蘇成敗和凍存及復蘇操作密切相關。上個星期和大家分享了細胞凍存方面容易出錯的細節，詳見《細胞復蘇失敗原因分析——凍存篇》。本篇主要從復蘇角度分析，排查復蘇過程中容易出現的問題。


復蘇步驟

同樣，我們先復習一下復蘇步驟：

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養基復溫，離心機設置好轉速；

2. 準備一個15ml離心管并加入適量培養基。

3. 取出凍存管，浸入水浴鍋迅速搖晃使細胞在2min內充分融化；

4. 將細胞懸液緩慢滴入提前加了培養基的離心管，1000rpm 3min離心；

5. 棄上清，重懸細胞并接種至培養器皿中，放入培養箱。


復蘇常見的錯誤操作

1. 若液氮或冰箱距離水浴鍋較遠，沒有做保冷措施

為防止細胞在運輸路上開始融化（特別是夏季），凍存細胞需要放在干冰或冰盒上運送至水浴鍋。


2. 運輸凍存管時手觸碰到細胞部分或放在了口袋里

請勿用手觸碰凍存管身，避免局部溫度升高導致細胞開始融化。應捏住管蓋或放在容器中運輸


3. 采用錯誤的方式融化細胞

不要用手捂化（搓熱也不行），手心溫度不夠高，細胞受熱不均勻且降溫速度太慢導致細胞死亡。


4. 水浴時沒有嚴格控制時間，直接放水里靜置，沒有晃動促進融化

細胞復蘇需遵循“快融”原則，建議在2min內將細胞充分融化，水浴時間越長活率越低。最好的方法是捏住管蓋，將管身浸沒水中快速搖晃，促進細胞融化。切忌將凍存管靜置在水浴中。


5. 水浴結束時管內還有較大冰塊

如果沒融化完全，還有比較大的冰塊，也會導致細胞死亡。一方面冰塊中的細胞緩慢升溫而死亡，另一方面冰塊導致已融化的細胞被低溫損傷。

有的同學說2min的水浴很難讓細胞融化，那么咱們可以將水浴鍋溫度提高至39度（小編親測可行），搖晃速度加快，擔心污染可以將凍存管放在一次性PE手套內再進行水浴。水浴鍋里的水不能太少，否則凍存管放入水后局部溫度會達不到預設溫度，導致融化過慢。


6. 細胞融化后沒有離心去除DMSO

有的同學復蘇細胞會在細胞融化后加10倍培養基稀釋，不離心直接培養，等細胞貼壁后換液。雖然這對于好養的貼壁細胞是可行的，但不是長遠之計，也不適用于懸浮細胞。DMSO對細胞有一定毒性，有些細胞對DMSO比較敏感，如HL-60細胞等。如果你不清楚自己的細胞是否對DMSO敏感，那么還是離心去除上清最為保險。


以上由小尚多年經驗總結而來，結合凍存篇，基本可以解決所有復蘇失敗的問題。如果還有沒提及的知識點，歡迎同學們可以在評論區補充~