高效液相色譜柱的分類與應用特點
高效液相色譜柱大致可分為五類:
一、高效反相液相色譜柱
以C18為代表的高效反相液相色譜柱一直被描述為藥物發現、開發、方法驗證(validation)的心臟! 高效反相液相色譜柱也極其廣泛應用在藥物代謝及動力學、生命科學、醫療健康、生物分析檢測、毒品和興奮劑檢測、食品安全分析、環境分析、軍事、國土安全等領域! 高效反相液相色譜制備柱也是最重要的分離純化技術之一!
無論是過去，現在和可預見的未來, 以球形B型硅膠(5um 或 3um)為材料骨架的高效反相液相色譜柱在實際應用中永遠占有統治地位!常規HPLC方法的開發幾乎總是從C18作為出發點，反相色譜占了80%以上的應用。
過去數十年來, 無數努力集注于:
1) 改善硅膠的品質, 優化鍵合化學; 2)開發新穎的材料骨架替代硅膠。
十多年前, 使用有機硅材料取代無機硅材料作為起始原料生產球形硅膠代表一個劃時代的革命! 生產的球形硅膠命名為B型球形硅膠。無機A型硅膠重金屬含量很高, 硅膠表面若干位置嚴重酸化及螯合效應等導致許多堿性化合物回收率低。球形B型硅膠重金屬含量很低, 在非常大的程度上消除了A型無機硅膠表面若干位置嚴重酸化及螯合效應等問題。用B型球形硅膠合成高效液相色譜填料, 導致高效液相色譜柱產品質量有質的飛躍!
然而，另一方面，基于客戶的大量反饋和我們對幾乎所有色譜廠商產品的評估, 我們相信鍵合化學問題沒有獲得很好的解決。具體體現在:
(1) “純粹”反相機理的鍵合相例如C18和C8市場上仍然是單功能，三功能和聚合物鍵合相"魚目混雜"。
(2) 鍵合相封端問題沒有獲得很好的解決, 一直是困擾色譜領域最大的問題! 迄今為止全部的嘗試只獲得有限的成功。
(3) 極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相
極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相是C18高效反相液相色譜"衛星群"中最重要的產品, 是C18和C8鍵合相最重要的補充。
極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相起源于Supelco ABZ。Supelco ABZ的鍵合方法是用aminopropyl鍵合相和長鏈羧酸縮合反應形成一個C16酰胺。
那么市場上的極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相群的主要問題是什么? 極性嵌入式鍵合相和所謂的水相C18主要問題是鍵合相泄漏, 鍵合相不穩定等。兩者之間的內在差異是: 極性嵌入式鍵合相鍵合相泄漏和鍵合相不穩定等問題能夠獲得很好的解決, 但使用極性硅烷試劑封端的所謂的水相C18鍵合相鍵合相泄漏和鍵合相不穩定等問題是不可逆轉的。
在類似C18鏈長度的硅烷試劑中嵌入極性酰胺或酰酯, 使得鍵合相親水, 在100%水相條件下穩定。但按照類似C18的鍵合化學, 鍵合覆蓋率低, 鍵合相不穩定。
Chrom-Matrix InnovationTM PEG鍵合相是非常極性的產品, 但測試結果表明: PEG鍵合相非常穩定, 在LC-MS測試中沒有檢測到泄漏。這一成功和我們在膠體與界面科學領域的長期經驗幫助我們成功開發了新型催化條件下新的鍵合化學。加上超臨界流體技術封端, Chrom-Matrix InnovationTM 極性酰胺或酰酯鍵合相比那么市場上的極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相群穩定得多。色譜柱產品質量和壽命有質的飛躍! 即使這樣, LC-MS測試顯示: Chrom-Matrix InnovationTM 極性酰胺或酰酯鍵合相仍然有非常低的泄漏。
(4) 無泄漏低孔和高比表面積C18鍵合相等是小分子化合物分離純化的終端保證!
制備型高效反相液相色譜柱, 制備型高效正相液相色譜柱, 制備型高效離子交換色譜柱和對應的閃光色譜(flash chromatograpy) 是小分子化合物分離純化最重要的終端保證!
但是市場上大多數色譜產品和閃光色譜(flash chromatograpy)鍵合相有明顯的泄漏。盡管泄漏在紫外可見檢測器中是看不見的, LC-MS信號非常明顯! 最重要的是泄漏的硅烷實實在在洗脫到顧客的終端純化產品中, 而且沒有考慮在內。
Chrom-Matrix公司成功地解決了上述所有問題! InnovationTM所有反相高效液相色譜產品都使用B型球形硅膠合成, 使用最優化個性化合成工藝, 使用超臨界流體封端, 使用LC-MS/MS和表面電荷滴定等多種獨特技術配合多種色譜測試保證產品的品質和批次重現性。其中大部分產品LC-MS/MS測試無泄漏, 極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相非常低的泄漏。
二、高效正相液相色譜柱
正相液相色譜是最早的色譜模式。直到現在, 合成后通過硅膠柱做進一步純化仍然是有機化學家日常工作的一個重要組成部分。在理論上, 幾乎所有的溶于正己烷，乙酸乙酯或異丙醇的有機化合物都可以用高效正相液相色譜分析。但在實際應用中，高效正相液相色譜的應用比高效反相色譜少得多。這是因為正己烷, 乙酸乙酯沒有像水，甲醇或乙腈那樣受歡迎。此外, A型硅膠正相液相色譜給客戶一個慣性思維: 高效正相液相色譜的平衡時間很長。
事實上, 高效正相液相色譜在制備規模的色譜純化中一直發揮了重要作用。這是因為:
(1) 高效正相液相色譜比高效反相色譜柱壓低得多。
(2) 高效正相液相色譜用的溶劑例如正己烷, 乙酸乙酯很容易通過旋轉蒸發除去。
(3) 吡咯等蒸發性溶劑徹底改善了堿性有機化合物在B型球形硅膠, Diol和PEG正相液相色譜柱上的峰形。
此外, 不管制備規模或分析測試,
(1) 結構異構體分離分析必須使用正相液相色譜或超臨界流體色譜。
(2) 環境中腐殖酸的結構鑒定必須使用甲基化或硅烷化消除小分子聚集, 然后使用正相液相色譜或超臨界流體色譜。這種小分子聚集的自然現象一定相當廣泛。
PEG正相液相色譜鍵合相等將讓客戶重新評估高效正相液相色譜的價值。
三、高效親水液相色譜柱
高效親水液相色譜是一個介于正相和反相高效液相色譜之間的運作模式。這個模式最早來自NH2色譜柱的糖分析應用。在此之后，逐步在Diol, 硅膠和親水性高分子鍵合相找到了一些有價值的應用。
近年來，高效親水液相色譜成為比較流行的色譜的運作模式, 主要是因為親水性化合物有良好的保留和高效親水液相色譜在LC-MS/MS中的應用。
盡管如此，迄今為止沒有權威的論文, 評論和教科書揭示了高效親水液相色譜真正的價值和局限性。
近年來，我們幫助客戶采用高效親水液相色譜的運作模式成功地開發和驗證了數以百計的HPLC和LC-MS/MS應用。我們總結出:
(1) 高效親水液相色譜是LC-MS/MS應用的第一選擇。請參閱我們的LC-MS/MS產品手冊應用案例。
(2) 除了InnovationTM TX多功能色譜柱, 所有親水液相色譜僅可用于分析，而不是制備規模的分離。
(3) 高效親水液相色譜流動相A是乙腈(pH值用少量的甲酸或其他調節), 流動相B是水(pH值用少量的甲酸或其他調節)。化合物洗脫秩序類似于正相液相色譜, 疏水性化合物首先洗脫, 然后是親水化合物。流動相A一般不使用甲醇或丙酮或其他有機溶劑。
(4) 進樣體積太大會導致一些峰值扭曲或分裂。柱承載能力通常是非常小的。
(5) InnovationTM TX, HP Amide, Silica三種高效親水液相色譜覆蓋99 ％以上的應用, NH2色譜柱用于簡單糖分析應用。
(6) 除了InnovationTM TX多功能色譜柱, 所有親水高效液相色譜柱柱效不如正相和反相高效液相色譜。
四、高效強陽離子交換液相色譜柱
離子交換液相色譜是生物分離最常見最有用的一種色譜模式。另一方面，小分子分離分析極少使用高效離子交換液相色譜。這是因為:
(1) 新穎的反相和多功能鍵合相例如InnovationTM Polar-Embedded Stable Amide和TX連續出現, 在很大的程度上補償了常規C18鍵合相的缺點。 C18, C8鍵合相也有重大進展。高效親水液相色譜柱也覆蓋了許多分析應用。
(2) 相比之下, 硅膠基質的高效離子交換鍵合相近幾十年來產品質量沒有取得質的突破。硅膠基質的高效離子交換鍵合相柱壽命普遍短, 疏水相互作用明顯。
(3) 聚合物基質的高效離子交換鍵合相在生物分析上面的應用比較廣泛, 但其柱效過低，表面積太小，對小分子分離分析難有吸引力。
科學發明往往來自現實世界的挑戰! 在對海洋毒素, 微生物代謝產物和天然植物(包括中草藥)有效成分的分離純化過程中, 我們深深感到高質量的硅膠基質的高效離子交換鍵合相是必不可少的! 因此，我們開發了硅膠基質的SCX, WCX, DEAE和SAX高效離子交換鍵合相。
五、InnovationTM高效多功能液相色譜柱
我們介紹四種高效多功能液相色譜柱:
(1) InnovationTMTX毒品分析HPLC柱
InnovationTM TX毒品分析HPLC柱是實際應用中最有價值的一種色譜柱。由于其在毒品分析上出色的表現, DEA專家稱它毒品分析HPLC柱。InnovationTM TX是一個多功能色譜柱, 具有反相, 弱陽離子離子交換, 親水等作用, 能夠使用在100%水相或100%有機相。由于它的弱陽離子離子交換機理, InnovationTM TX對堿性化合物的分離效果是所有色譜柱中最好的。它對堿性化合物有完美的峰形。
它的絕對柱效和反相色譜分析柱相同的，甚至優于反相, 遠勝傳統的親水色譜分析柱。
(2) InnovationTM DNPH HPLC柱
InnovationTM DNPH HPLC柱主要用于環境中醛和酮DNPH衍生物分析。在特定的DNPH衍生物分析應用中, 任何其他色譜柱沒有它優越的選擇性。
(3) InnovationTM PAH HPLC柱
(4) 血漿，血清直接進樣的InnovationTM PEG色譜柱
限制進入鍵合相(Restricted access media)最早由Merck公司發明。一個典型的方法是首先制造Diol鍵合相, 然后通過酰酯或酰胺反應嵌入疏水鏈。硅膠外表面的酰酯或酰胺鏈使用酶切斷開。但酶不能擴散到內表面。由此外表面親水, 內表面疏水。血漿，血清, 尿樣可以直接進樣。蛋白質等生物流體通過親水外表面時沒有保留, 小分子化合物可以擴散到內表面通過反相保留最后洗脫。限制進入鍵合相(Restricted access media)在學術領域比較歡迎, 但隨著固相萃取產品的發展, 在工業領域的應用相當少。
但我們最后發現, 血漿，血清, 尿樣可以直接進樣的限制進入鍵合(Restricted access media), 尤其是InnovationTM PEG色譜柱在藥物代謝領域具有獨特價值。藥物代謝研究, 尤其是全盲條件下的早期藥物代謝研究, 追求絕對回收率! 一種藥物代謝之后, 打破成許多小分子化合物。全盲條件下不可能使用固相萃取回收全部小分子代謝產物。最理想的方法是, 血漿，血清, 尿樣可以直接進樣, 每毫升收集液使用14C同位素檢測, 然后建立一個明確的代謝概況。
InnovationTM PEG色譜柱是一種多功能色譜柱。它是最好的正相色譜柱! 同時，使用乙醇取代儲存溶劑后, 它能夠被用來作為反相讓血漿，血清, 尿樣可以直接進樣。
